长期以来，人们一直认为人和成年哺乳动物中枢神经系统不存在神经干细胞（Neural stem cells, NSCs），脑和脊髓中神经元一旦死亡，将不能再生。直到1992年，Reynolds等首先报道从成年哺乳动物纹状体中培养出多潜能神经干细胞，彻底打破了这一传统观念。近年来，胚胎和神经干细胞移植在治疗多种神经系统变性疾病中获得成功，NSCs开始广泛用于神经再生、修复和功能重建研究。但因受来源和道德、伦理方面的限制，人NSCs不易获得；目前建立的NSCs系又绝大多数来源于鼠类，与人存在显而易见的种属差异。因此，人们正在积极寻求一种更为理想的、可替代NSCs的干细胞来源。大量研究证实骨髓间质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）具有多种分化潜能，在适当条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、肝细胞、韧带、真皮甚至神经细胞。最近有人采用脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor, BDNF）和神经生长因子（Nerve growth factor, NGF）等成功地将BMSCs体外诱导分化为神经元和神经胶质细胞，但向神经元分化的比率很小。因此，如何提高BMSCs向神经元的定向分化率成为近年来神经科学领域的研究热点。核转录因子κB配体受体激动因子（Receptor activator of NF-Kappa B ligand, RANKL）是近年来发现的一个新的细胞因子，可诱导神经元的两种单胺类神经递质的受体组胺（Receptors for histamine, H2R）和肾上腺素能儿茶酚胺受体（α1-adrenergic catecholamine receptor, ADRA1A）表达上调，并通过激活NF-κB在细胞的生长调控中发挥重要作用，但RANKL在BMSCs向神经细胞分化中的作用迄今为止国内外未见报道。为此，我们进行了RANKL对成人骨髓间质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells, hBMSCs）向神经细胞分化的影响研究。研究包括以下四部<WP=5>分：(1) RANKL体外诱导hBMSCs向神经细胞定向分化的研究；(2) hBMSCs移植对大鼠脊髓损伤神经功能恢复的影响；(3) RANKL在大鼠脊髓损伤后hBMSCs移植中的作用；(4) RANKL在大鼠局灶性脑缺血后hBMSCs移植中的作用研究。通过体内外神经细胞分化结果对比，探讨RANKL 对hBMSCs神经细胞分化的影响，为RANKL 和 hBMSCs在神经科学领域的应用提供理论依据。1．RANKL体外诱导成人骨髓间质干细胞分化为神经细胞的研究 本研究目的在于研究RANKL体外诱导hBMSCs分化为神经元和神经胶质细胞的可行性，探讨RANKL在hBMSCs向神经细胞分化中的作用。 无菌条件下，取因胸外科手术入路需要摘取的正常成人肋骨，从骨髓中分离单个核细胞，接种于塑料培养瓶中，37℃ CO2培养箱中DMEM培养。待贴壁细胞生长铺满瓶底后，消化传代，获得第一代hBMSCs。我们采用第二代hBMSCs进行诱导分化，按1×104细胞/ml密度接种于培养板中，培养基换为含胰岛素、转铁蛋白、黄体酮、全反式视黄酸的DF12培养基，是为对照组。BDNF组、RANKL组和RANKL+BDNF组分别在此培养基中加入BDNF 100ng/ml、sRANKL 20ng/ml和BDNF 100ng/ml+sRANKL 20ng/ml。倒置显微镜动态观察细胞生长情况，细胞诱导分化前和诱导分化后1、3、5、7 d，应用免疫细胞化学方法检测培养细胞的神经元标志—神经元特异性烯醇化酶（Neuron-specific enolase, NSE）和神经胶质细胞标志—胶质纤维酸性蛋白（Glial fibriliary acidic protein, GFAP）的表达情况。 成人骨髓单个核细胞最初接种到培养瓶中时绝大部分为圆形或类圆形的球体样细胞；4~6 h后，部分细胞开始贴壁，呈梭形成纤维细胞样或上皮细胞样生长；3 d大部分细胞呈贴壁生长，细胞多呈梭形或扁平形；原代培养第10~13 d后，细胞长满培养瓶底，胞体变得细长，形态类似成纤维细胞。 第二代hBMSCs诱导分化1 d后，RANKL+BDNF组可见个别细胞形态发生变化，原来宽大扁平的细胞胞质变窄、向核收缩，其余3组<WP=6>未见类似改变。3 d时，各组均有不同数量的细胞伸出长突起，细胞核体积缩小，细胞呈纺锤形或梭形，以RANKL+BDNF组最多，个别细胞已分化为胞体呈锥形并伸出多个长突起的神经样细胞；BDNF组、RANKL组依次次之，对照组很少；5 d时，各组多突起神经样细胞逐渐增多，尤以RANKL+BDNF组最为明显，胞体呈锥形，突起交织成网状，同时各组均伴有不同程度的细胞死亡导致细胞总数下降。7 d时RANKL+BDNF组约95%以上的存活细胞变形为典型的神经样细胞；而BDNF组、RANKL组和对照组的神经样细胞分别约占存活细胞的80%、70%和15% 。 细胞诱导分化前及诱导分化后1 d， RANKL+BDNF组、BDNF组和RANKL组均未见到NSE、GFAP阳性细胞；诱导分化后3 d，以上三组均可见到少量NSE、GFAP阳性细胞，但对照组则未发现；5 d时对照组开始出现NSE、GFAP阳性细胞，但其数目却远比其它各组少（p<0.05）。在其它三组中，NSE、GFAP阳性细胞数也不尽相同。RANKL+BDNF组NSE阳性细胞数明显高于BDNF组和RANKL组（p<0.005），其GFAP阳性细胞数也显著高于RANKL组（p<0.001），但与BDNF组相比则无显著性差异（p>0.10）；RANKL组NSE阳性细胞数和BDNF组无显著性差异（p>0.10?