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鸭病毒性肠炎(Duck Virus Enteritis,DVE)又名鸭瘟(Duck Plague,DP),是由鸭肠炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)引起的鸭、鹅等禽类的一种急性、接触性传染病,其特征是血管损伤、组织出血、消化道黏膜糜烂、淋巴器官病变、实质性器官退行性病变,各种年龄的禽均可发病。鸭肠炎病毒(Duck Enteritis Virus,DEV)又名鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV),系α疱疹病毒亚科成员之一,但属的划分尚无定论。本研究通过提取DEV基因组,对不同的DEV毒株进行限制性酶切分析;通过构建含有EGFP完整阅读框的真核转染重组质粒对DEV基因组中的复制非必需区进行了初步筛选,为进一步研究DEV奠定一定的实践基础。1.将DEV疫苗株和分离株在鸡胚成纤维细胞上增殖。分离株经两次传代即可适应鸡胚成纤维细胞培养系统,且病毒滴度随培养代次的增加而不断提高。2.采用两种不同的方法提取鸭肠炎病毒基因组核酸。第一种方法先采用差速离心的方法纯化病毒粒子,再用苯酚/氯仿抽提即得到病毒核酸。第二种方法首先用高渗液使细胞完全破碎,然后加入微球菌核酸酶将细胞DNA完全消化,再加入蛋白酶K将细胞蛋白以及病毒的蛋白衣壳消化,最后用苯酚/氯仿抽提即得到病毒基因组核酸。限制性内切酶EcoRⅤ消化,结果表明第二种方法得到的DNA纯度较高,无细胞DNA污染。用PCR方法对提取的样品进行鉴定,证明获得的DNA样品确为DEV基因组。用8种限制性内切酶对DEV疫苗株和分离株的基因组进行酶切比较分析,酶切产物电泳结果表明,XboⅠ和EcoRⅤ产生的酶切图谱两者几乎完全一致,MluⅠ、HindⅢ、和KpnⅠ仅有个别条带不同,而EcoRⅠ、BglⅡ和ApaLⅠ产生的条带数目和条带迁移率差别比较明显。3.用PCR方法扩增获得鸭肠炎病毒TK基因并将其克隆入pMD18-T载体,将完整的EGFP阅读框插入TK内部的EcoRⅤ位点,构建出转移载体pTK-EGFP。利用PCR技术扩增出US2全基因,并将其克隆入pGM-T载体。用BamHⅠ和EcoRⅤ双酶切重组载体,使US2基因内部缺失约130bp片段,将完整的EGFP阅读框插入BamHⅠ和EcoRⅤ酶切位点之间,构建了转移质粒载体pUS2-EGFP。用一个1.9 kb DEV基因组BamHⅠ酶切片段构建转移载体,该片段含有病毒基因组US1-US10片段大部分基因。用MluⅠ和NruⅠ两种限制酶双酶切,使US1 ORF 3’末端至US10 ORF 5’末端之间583 bp片段缺失,将EGFP阅读框连入MluⅠ和NruⅠ位点之间,构建出转移载体pUS1-EGFP-US10。4.利用Lipofectamine2000将重组质粒转染已感染DEV的CEF,通过优化细胞数量和转染质粒的数量,确定了最佳转染条件。经过传代和纯化,重组质粒能够通过与DEV在CEF中发生同源重组得到稳定表达绿色荧光蛋白的重组病毒,重组病毒能够在CEF上传3~4代,并形成绿色的荧光斑,说明TK、US2、US1和US10为DEV基因组的复制非必需区。