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目的探讨RNA干扰重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)介导微小染色体维持蛋白7(miniehromosome maintenanceprotein7,MCM7)基因沉默后,对人肝癌SMMC-7721细胞MCM7基因表达、细胞增殖、凋亡及裸鼠移植瘤生长的影响和可能机制。方法1.以荧光实时逆转录定量PCR(qRT-PCR)技术检测MCM7基因mRNA在SMMC-7721,HepG2,SK-hep-1三种人肝癌细胞系中的表达水平,筛选实验用目的细胞。2.利用RNA干扰技术,设计合成4个特异性靶向MCM7基因shRNA载体(MCM7-shRNA表达载体),稳定转染至人肝癌SMMC-7721细胞,并对不同靶点进行有效筛选。3.将人肝癌细胞SMMC-7721随机分为3组:以MCM7基因沉默重组慢病毒颗粒(LV-shRNA-MCM7)感染SMMC-7721,作为实验组(KD);以对照慢病毒颗粒(LV-shRNA-NC)感染SMMC-7721,作为阴性对照组(NC);空白对照组(CON)常规培养,不做任何处理。应用荧光实时逆转录定量PCR(qRT-PCR)和Western blot技术检测MCM7基因mRNA和蛋白的表达,评价干扰效果。4.应用MTT法检测细胞体外增生能力,Giemsa染色法检测各组细胞的克隆形成;流式细胞技术(flow cytometry,FCM)分别检测各组细胞增殖和凋亡的变化情况。5.通过嘌呤霉素筛选出稳定转染细胞株。三组细胞分别接种至裸鼠皮下,建立人肝癌裸鼠移植瘤模型。观察裸鼠成瘤情况、移植瘤生长情况并绘制肿瘤生长曲线;4周后测定肿瘤体积和重量,并用荧光实时逆转录定量PCR(qRT-PCR)、Western blot及免疫组织化学法检测移植瘤中MCM7的mRNA及蛋白表达水平。结果1.实时荧光定量PCR结果显示人肝癌SMMC-7721细胞中MCM7基因表达水平在三种细胞中最高,且细胞表达的基因丰度适合做敲减验证,选取人肝癌SMMC-7721细胞为目的细胞。2.成功构建MCM7-shRNA表达载体,经测序验证无误,感染人肝癌SMMC-7721细胞后,细胞荧光显示感染率均>90%,内源性靶点得到确认。3.实时荧光定量PCR及Western blot结果显示:实验组的四种靶点MCM7-shRNA干扰序列中,和阴性对照组和空白对照组比较, MCM7mRNA和MCM7蛋白的表达水平下调均达50%以上,其中以LV-shRNA-MCM7(4)号靶点敲减效率最高,分别达88.95%、87.89%和82.25%、81.63%,差异具有统计学意义(P<0.05),以此作为实验组。4.MTT法结果显示:实验组细胞490nm处的吸光光度值在转染后24、48、72和96h时均低于阴性对照组、空白对照组,差别显著(P<0.05)。同时Giemsa染色法结果显示: LV-shRNA-MCM7组的克隆形成率(6.00%±0.50%)明显低于空白对照组(14.10%±0.36%)、阴性对照组(13.73%±0.17%),实验组细胞生长明显受到抑制(P<0.05)。流式细胞技术显示:实验组较阴性对照组、空白对照组G1期延长,S期缩短,差别显著(P<0.05)。实验组细胞凋亡率为(22.27%±1.22%),明显高于阴性对照组(0.05%±0.07%)和空白对照组(0.03%±0.06%),实验组较阴性对照组、空白对照组出现了明显的细胞凋亡(P<0.05)。5.裸鼠接种癌细胞后第4天空白对照组和阴性对照组裸鼠有肿瘤形成,实验组裸鼠延迟2天后有肿瘤形成,至第6天均有肿瘤形成;与空白对照组和阴性对照组相比,实验组的肿瘤生长速度明显减慢(P<0.05),实验组、阴性对照组、空白对照组的瘤体平均体积分别为:(27.72±7.80)mm3,(81.86±10.91)mm3,(79.75±16.61)mm3,瘤体平均重量为:(0.19±0.06)g,(0.501±0.14)g,(0.509±0.18)g,实验组瘤体体积及重量明显小于阴性对照组和空白对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),移植瘤组织MCM7mRNA和蛋白表达均明显下降(P<0.05)。结论1. MCM7基因的RNAi重组体可以有效的抑制MCM7基因的mRNA和蛋白表达。2.RNA干扰技术沉默MCM7基因能够抑制肝癌细胞的生长,阻滞细胞周期于G1期,促进其凋亡.3.慢病毒沉默SMMC-7721细胞中MCM7基因表达能有效抑制人肝癌裸鼠移植瘤的生长。4.提示MCM7基因可能成为肝癌基因治疗的一个有效靶点。