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肺癌是最常见的恶性肿瘤之一。由于不良生活习惯和环境污染等因素,其发病率不断上升(近30年来我国肺癌发病率上升了465%),已成为我国发病率、死亡率第一的恶性肿瘤[1]。然而,目前临床肺癌综合治疗措施的效果尚不理想,患者5年生存率<15%[2]。因此,寻找新的治疗靶点和新的治疗方法,显得尤为迫切。线粒体是真核细胞最重要的供能细胞器,参与能量代谢、保持离子稳态、细胞增殖和凋亡等众多生理/病理过程。线粒体DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)作为真核细胞唯一的核外遗传物质,编码13个与能量代谢相关的多肽,其损伤和转录障碍将导致所编码的多肽表达减少,电子传递链效率下降,渗透性转换孔开放,细胞凋亡[3];越来越多的证据表明,线粒体结构和功能的改变,不仅会干扰肿瘤细胞的生长、能量代谢和增殖等过程,最终还会触发肿瘤细胞凋亡及坏死[4]。因此,以肺癌细胞线粒体作为治疗靶点是一个值得探索的方向。如果能应用反义技术和反义物质,特异性地封闭肺癌细胞mtDNA的转录启动子,则可能导致线粒体蛋白质合成系统障碍,从而引起线粒体电子传递链障碍,继而影响肺癌细胞的生存和正常功能的维持。本研究1.观察比较了多种肺癌细胞和正常人支气管上皮细胞线粒体膜电位,证实了肺癌细胞的线粒体膜电位是高于正常人支气管上皮细胞的线粒体膜电位。2.构建了反义肽核酸(Anti-sense peptide nucleic acid, asPNA)-三苯磷复合物,利用电子移位亲脂性阳离子类物质(delocalized lipophilic cations, DLCs)-三苯磷,能够在高线粒体膜电位的推动下,选择性地积聚于肺癌细胞线粒体内的特性[5],运载针对mtDNA重链转录启动子区域的asPNA,阻抑肺癌mtDNA编码基因的转录,观察其对肺癌细胞能量产生、凋亡/坏死等生物学特性的影响。研究过程中,我们发现肺癌细胞群体内部,线粒体膜电位也存在明显的异质性,而这种异质性同肺癌细胞分化程度之间存在联系,即肺癌干细胞亚群的线粒体膜电位高于分化的肺癌细胞。3.我们在分离鉴定肺癌干细胞的基础上,还进一步观察了asPNA-三苯磷复合物转染后,对肺癌干细胞亚群生物学性质的影响。方法:1.分别采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜检测比较不同肺癌细胞系(SPC-A1、H446)与正常人支气管上皮细胞(Human Bronchus Epithelium,HBE)的线粒体膜电位。2.设计并用固相合成法合成asPNA-三苯磷复合物;用高压液相色谱法和质谱法进行鉴定;激光共聚焦显微镜观察复合物转染肺癌SPC-A1细胞;RT-PCR法检测asPNA-三苯磷复合物转染后SPC-A1细胞mtDNA重链编码基因ATP合酶8(ATPase8)表达情况;自发光荧光仪检测asPNA-三苯磷复合物转染后SPC-A1细胞的ATP合成的变化;用PI标记流式细胞术观察asPNA-三苯磷复合物转染后SPC-A1细胞后的细胞周期;Annexin-ⅴ-PI双染流式细胞术检测asPNA-三苯磷复合物转染后SPC-A1细胞凋亡/坏死。3.观察不同肿瘤细胞系(A549、SPC-A1、H446、SGC、Hela)的克隆异质性;并用激光共聚焦显微镜检测不同克隆中细胞的线粒体膜电位;了解肿瘤细胞线粒体膜电位的异质性;免疫荧光法检测SPC-A1细胞不同克隆中干细胞标志物的表达情况;激光共聚焦显微镜观察不同克隆中SP细胞的分布情况及不同克隆中细胞线粒体的分布情况。4.根据肺癌细胞紧密型克隆具有干细胞特性,采用改进的无血清干细胞培养法,于SPC-A1中培养肺癌干细胞球;获取肺癌干细胞球后,免疫荧光激光共聚焦显微镜检测其CD133表达;利用裸鼠成瘤实验检测肺癌干细胞的致瘤能力;流式细胞仪检测比较肺癌干细胞球和分化肺癌SPC-A1细胞的线粒体膜电位。5.激光共聚焦显微镜观察asPNA-三苯磷复合物转染肺癌干细胞的效果,利用裸鼠成瘤实验检测转染asPNA-三苯磷复合物肺癌干细胞的成瘤能力。6.统计学分析:数据以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,以SPSS12.0软件进行分析。P<0.05为差异显著。结果:1.肺癌细胞的线粒体膜电位要高于正常人支气管上皮细胞。流式细胞术检测结果:荧光强度代表线粒体膜电位,SPC-A1(266.9±24.4, P < 0.01)和H446细胞(194.4±17.0,P < 0.01)高于HBE (138.1±19.7)。激光共聚焦显微镜检测结果:荧光强度代表线粒体膜电位,SPC-A1(1.90±0.06,P< 0.01)和H446细胞(1.91±0.03,P< 0.01)高于HBE(1.72±0.02)。2.asPNA-三苯磷复合物符合要求。asPNA-三苯磷复合物高压液相色谱鉴定结果显示,在22.1 min处可见一单峰,未见明显的杂质峰,与标准品一致;添加电荷后,质谱分析:复合物分子量为3982.2,而设计asPNA-三苯磷复合物,其分子量为3979.9,表明:asPNA-三苯磷复合物符合设计要求。3.asPNA-三苯磷复合物进入SPC-A1细胞线粒体并产生预期生物学效应。激光共聚焦显微镜观察显示asPNA-三苯磷分布于细胞质中,形态和空间分布同线粒体基本一致,表明asPNA-三苯磷复合物能够进入肺癌SPC-A1细胞线粒体内。RT-PCR结果显示asPNA-三苯磷复合物转染后SPC-A1细胞mtDNA重链编码基因ATPase8转录水平下降;流式细胞仪检测发现asPNA-三苯磷复合物转染组可见明显的亚二倍体峰,凋亡检测显示转染后SPC-A1细胞的凋亡率也增加(转染:11.83%±0.66%,未转染:2.56%±0.71%),提示,部分细胞发生了凋亡/坏死;对转染组和未转染组ATP的检测发现asPNA-三苯磷复合物转染肺癌SPC-A1细胞能够减低ATP的合成(转染:1.2049±0.1122 nmol/mg蛋白,未转染:2.1983±0.1570 nmol/mg蛋白,P< 0.01)。4.肿瘤细胞线粒体膜电位存在异质性,且与细胞分化状态相关。激光共聚焦显微镜对肿瘤细胞系不同克隆细胞线粒体膜电位检测结果:紧密克隆中细胞线粒体膜电位要高于松散型克隆(A549紧密型:854.5±71.96,松散型:618.9±62.2,P< 0.01;SPC-A1紧密型:2029.8±45.9,松散型:1016.6±104.5,P< 0.01;H446紧密型:1175.6±115.3,松散型:848.2±93.8,P< 0.01;SGC紧密型:1498.9±169.2,松散型:912.3±67.1,P< 0.01;Hela紧密型:835.9±98.6,松散型:531.2±44.8,P< 0.01)。肺癌紧密型克隆的细胞具有能够表达干细胞标志物、细胞的线粒体分布更靠近细胞核等干细胞特性。5.获得肺癌干细胞球,并初步鉴定。利用改进的无血清培养法,成功获得呈球状生长的肺癌干细胞球,所培养的肺癌干细胞球表达干细胞标志物CD133,具有较强的成瘤能力。6.肺癌干细胞球线粒体膜电位高于分化的肺癌SPC-A1细胞。流式细胞术检测结果:荧光强度代表线粒体膜电位,肺癌干细胞(84.45±12.54)高于SPC-A1(53.53±3.35,P<0.01)。7.asPNA-三苯磷能够顺利进入肺癌干细胞内,并影响其成瘤能力。激光共聚焦观察显示asPNA-三苯磷分布于细胞质中,形态和空间分布同线粒体基本一致,荧光物质靠近细胞核周分布相对较密集,符合干细胞线粒体分布规律,提示asPNA-三苯磷复合物能够顺利的转染肺癌干细胞线粒体内。结论:1.肺癌细胞的线粒体膜电位高于正常人支气管上皮细胞。2. asPNA-三苯磷复合物能够在高线粒体膜电位的推动下,积聚于肺癌细胞内,并阻抑其线粒体DNA编码基因的表达,干扰能量代谢,导致细胞凋亡。3.肺癌细胞群体内,线粒体膜电位存在异质性,并同细胞分化程度呈负相关。4. asPNA-三苯磷复合物能够在高线粒体膜电位的推动下进入肺癌干细胞内,并降低其成瘤能力。提示该复合物可能也具备影响肺癌干细胞生物性质的能力。