足细胞(podocyte)是高度分化的肾小球上皮细胞,是构成肾小球滤过屏障的主要组分之一。在糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)中,足细胞受损是导致糖尿病肾损伤的早期事件。足细胞凋亡与足突的融合脱落是造成肾小球滤过屏障受损的重要原因,也是导致蛋白尿产生的关键因素。但是足细胞损伤机制十分复杂,目前尚无有效治疗措施。因此,深入探讨足细胞损伤的机制并进一步寻找潜在治疗靶点对糖尿病肾病的防治具有重要的临床意义。线粒体是细胞能量代谢的重要场,对维持细胞稳态十分重要。病理条件下线粒体生物合成功能受阻,线粒体DNA的损伤以及线粒体ROS的产生都是造成线粒体功能障碍的重要因素。越来越多的研究表明线粒体功能障碍是导致糖尿病病理进程的的关键因素之一。足细胞线粒体的损伤出现在包括糖尿病肾病以及高脂饮食诱导的肾小球疾病在内的多种肾脏疾病中。颗粒蛋白前体(progranulin,PGRN)是一种自分泌型生长因子,在肿瘤发生、免疫炎症反应中具有重要的调节作用,本研究前期工作发现PGRN在糖尿病肾病小鼠中表达显著降低,而PGRN的缺失加重了糖尿病肾病小鼠肾小球损伤。但是,PGRN减轻足细胞损伤的调控机制,特别是是否参与到线粒体稳态的调控尚不明确。因此,本论文进一步阐明PGRN在维持足细胞线粒体稳态中的作用及其分子机制,将对寻找针对足细胞损伤的潜在治疗靶点提供理论基础。研究目的1.明确PGRN对于糖尿病肾病足细胞线粒体损伤的保护作用。2.阐明PGRN维持足细胞线粒体功能与稳态平衡的分子机制。研究方法第一部分明确PGRN对于糖尿病肾病足细胞线粒体损伤的保护作用1.1 PGRN基因缺失加重糖尿病小鼠足细胞损伤:选取8w雄性野生型小鼠和PGRN基因敲除同笼小鼠,构建糖尿病肾病小鼠模型。检测小鼠空腹血糖水平;代谢笼收集小鼠尿液,检测并计算尿微量白蛋白肌酐比值(urinary microalbuminuria/creatinine ratio,UACR)。利用免疫荧光染色(immunofluorescence,IF)实验标记Caspase3及脱氧核苷酸末端转移酶介导的 dUTP 缺口末端标记(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)实验观察肾小球细胞的细胞死亡;肾小球足细胞标志蛋白Wilms瘤1(Wilms Tumor 1,WT1)染色观察足细胞数目变化。1.2 PGRN缺失加重糖尿病肾病小鼠足细胞和肾小球内皮细胞线粒体损伤:利用透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检测糖尿病肾病小鼠足细胞以及内皮细胞线粒体损伤。进一步免疫组化(immunohistochemical,IHC)染色检测线粒体蛋白COXIV的表达水平。1.3重组PGRN对糖尿病肾病小鼠的保护作用:纯化人重组PGRN蛋白(recombinant PGRN,rPGRN)。构建糖尿病肾病小鼠模型并注射rPGRN(10mg/kg)进行治疗。过碘酸雪夫染色PAS(periodicacid-schiff stain,PAS)检测肾小球形态学损伤,TUNEL染色观察肾小球细胞死亡。WT1染色和Nephrin/Podocin染色观察肾小球足细胞损伤,TEM观察足细胞足突损伤变化,使用Imagej软件统计足细胞基底膜厚度(GBM thickness),足突宽度(foot process width)和每微米基底膜足突的数目(number of foot process/μm GBM)。1.4rPGRN对高糖处理的足细胞线粒体损伤的影响:高糖(high glucose,HG,40mM)刺激足细胞并加入rPGRN(500ng/ml)。TEM观察足细胞线粒体形态并统计线粒体形态改变及线粒体直径。使用线粒体荧光探针Mitotracker Green观察线粒体形态完整性及线粒体断裂。进一步利用线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)检测探针(JC-1)检测线粒体膜电位水平的改变。1.5 PGRN在肾脏足细胞的表达模式:IHC检测糖尿病肾病患者、癌旁正常组织以及糖尿病非肾病患者肾穿刺样本PGRN的表达变化。体外培养人足细胞(human podocyte,HPC)、小鼠足细胞(mouse podocyte,MPC)以及人肾小管上皮细胞(human tubular epithelial cell,HK-2),给予 HG 刺激,蛋白免疫印迹(Western blot,WB)检测PGRN的表达变化。小鼠肾组织进行WT1与PGRN免疫荧光双标实验,检测PGRN在足细胞内表达变化。1.6 PGRN表达变化受C/EBPβ调控:体外培养HPC,HG条件下WB检测足细胞内C/EBPβ的表达变化;沉默C/EBPβ表达,WB检测HG处理的HPC中PGRN的表达变化。第二部分阐明PGRN维持足细胞线粒体功能与稳态平衡中分子作用机制1 PGRN对于足细胞线粒体生物合成的调控作用体外HG刺激HPC加入rPGRN(500ng/ml),WB检测线粒体生物合成相关蛋白PGC1α 和 TFAM 的表达变化;实时定量 PCR(quantitative real time PCR,QPCR)检测PGC1α和TFAM的mRNA 水平表达变化。提取足细胞总DNA,QPCR检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)水平。2 PGRN对于足细胞线粒体自噬的调控2.1 PGRN对于线粒体自噬水平的调控:利用野生型和PGRN基因缺失小鼠构建糖尿病肾病小鼠模型,WB检测小鼠肾皮质中线粒体自噬相关蛋白PARK2的表达水平。体外,WB检测HG处理的HPC中线粒体自噬相关蛋白PINK1、PARK2的蛋白水平,QPCR检测二者mRNA水平。TEM观察足细胞内线粒体自噬小体数目;IF标记线粒体蛋白TOMM20和自噬相关蛋白LC3观察线粒体自噬水平。2.2 PGRN通过调控线粒体自噬保护足细胞:沉默线粒体自噬相关蛋白PARK2的表达,WB检测凋亡相关蛋白PARP1的剪切水平,流式细胞术检测HG处理的足细胞凋亡。2.4 PGRN调控足细胞的自噬水平:IF标记自噬相关蛋白LC3和足细胞标志蛋白WT1,检测野生型和PGRN基因缺失糖尿病小鼠足细胞自噬水平。体外培养HPC,WB检测LC3蛋白水平。进一步加入自噬抑制剂3-MA,流式细胞术检测足细胞凋亡。使用RNA沉默技术抑制足细胞PGRN的表达,进行高糖处理,Tandem检测PGRN对于自噬流的调控作用。IF检测野生型和PGRN基因缺失糖尿病小鼠足细胞内p-AMPK的水平。Tandem检测干扰AMPKα对HG处理的HPC中自噬流的影响。进一步为明确AMPK各亚型对于自噬流的调控作用,分别沉默AMPKα1和AMPKα2表达,Tandem检测各亚型对于自噬流的调控。3 PGRN调控组蛋白去乙酰化酶Sirt1/PGC1α/FoxO1通路体外培养HPC,WB检测足细胞内组蛋白去乙酰化酶SIRTs家族Sirt1-7的表达变化。提取糖尿病肾病小鼠肾皮质蛋白通过WB检测Sirt1在WT和PGRN基因缺失小鼠中的表达变化,进一步WB检测注射rPGRN后肾皮质中Sirt1的表达变化。分别利用免疫沉淀(immunoprecipitation,IP)和 WB 检测 rPGRN 对 HG 处理的 HPC 中 PGC1α 和FoxO1的乙酰化水平影响。4 PGRN通过调控Sirt1改善线粒体稳态平衡4.1 PGRN通过Sirt1调控线粒体自噬:基因沉默Sirt1,HG刺激足细胞并加入rPGRN,WB检测FoxO1乙酰化水平及下游线粒体自噬相关蛋白PINK1和PARK2蛋白水平。TOMM20与LC3免疫荧光双标染色观察线粒体自噬水平。4.2 PGRN通过Sirt1调控线粒体生物合成:基因沉默Sirt1,IP检测PGC1α乙酰化水平。功能上,JC-1法检测线粒体膜电位水平;QPCR检测mtNDA水平;流式细胞术检测细胞死亡。研究结果第一部分明确PGRN对于糖尿病肾病足细胞线粒体损伤的保护作用1.1 PGRN基因缺失加重糖尿病小鼠足细胞损伤:检测小鼠UACR水平发现PGRN缺失明显加重糖尿病小鼠蛋白尿的产生,TUNEL染色以及Caspase3活性检测结果显示PGRN缺失促进肾小球细胞的死亡,WT1染色结果显示PGRN缺失使糖尿病小鼠足细胞数目进一步降低。1.2 PGRN缺失小鼠加重糖尿病肾病小鼠线粒体的损伤:TEM观察发现糖尿病肾病小鼠足细胞线粒体损伤,PGRN的缺失进一步加重线粒体的损伤,IHC结果显示PGRN缺失糖尿病肾病小鼠足细胞线粒体呼吸链蛋白COXIV的表达水平进一步降低。1.3 rPGRN对于糖尿病肾病小鼠的保护作用:给予糖尿病肾病小鼠注射rPGRN后,显著降低蛋白尿的产生。注射rPGRN可以降低糖尿病肾病小鼠的肾小球糖原的累积和系膜增生,减轻糖尿病肾病小鼠肾小球细胞的死亡。WT1染色结果显示rPGRN可以恢复糖尿病肾病小鼠肾小球足细胞的数目。透射电镜结果显示rPGRN明显改善糖尿病肾病小鼠足细胞足突的融合消失,基底膜的增厚。1.4 rPGRN对于线粒体损伤的调控:TEM观察发现高糖条件下足细胞内线粒体肿胀嵴结构消失,而加入rPGRN可以部分恢复线粒体形态。Mitotracker Green染色结果显示高糖促进足细胞线粒体断裂,破坏线粒体结构完整性,而加入rPGRN可以降低线粒体断裂水平,保持线粒体结构完整性。线粒体膜电位MMP的检测结果显示rPGRN可以恢复高糖所诱导的线粒体膜电位水平的降低。1.5 PGRN在肾脏足细胞的表达模式::IHC观察发现糖尿病肾病患者肾脏PGRN的表达水平显著降低,而糖尿病非肾病患者肾脏的PGRN水平无明显变化。体外实验结果显示PGRN在HPC以及MPC中均显著降低,在HK-2中也有一定的降低。1.6 PGRN表达变化受C/EBPβ调控:C/EBPβ在高糖条件下表达显著降低,而沉默C/EBPβ后PGRN表达降低,加入高糖刺激PGRN表达进一步降低。第二部分阐明PGRN维持足细胞线粒体功能与稳态平衡中分子作用机制1.PGRN对于线粒体生物合成的调控作用结果显示足细胞线粒体生物合成相关蛋白PGC1α和TFAM在高糖条件下表达水平显著降低,加入rPGRN后可部分恢复二者表达水平。mtDNA实验结果显示加入rPGRN可以促进高糖条件下mtDNA水平。2.PGRN对于足细胞线粒体自噬的调控2.1 PGRN对于足细胞线粒体自噬水平的调控:肾皮质中线粒体自噬相关蛋白PARK2水平降低,而PGRN的缺失进一步加重PARK2表达水平的降低。rPGRN可以明显恢复高糖诱导的线粒体自噬相关蛋白PINK1和PARK2的蛋白及mRNA表达水平。TEM观察发现rPGRN的加入可以增加高糖条件下人足细胞线粒体自噬小体的数目。共聚焦结果显示高糖环境下线粒体蛋白TOMM20和自噬蛋白LC3的共定位降低,而加入rPGRN可以促进两者的共定位。2.2 PGRN通过调控线粒体自噬保护足细胞:WB检测PARK2的沉默效率,流式细胞术检测结果表明沉默PRRK2降低PGRN对于高糖条件下足细胞凋亡的保护作用,降低PGRN对于高糖条件下PARP1剪切水平的调控作用。2.3 PGRN调控足细胞的自噬水平:PGRN缺失造成足细胞内LC3蛋白水平进一步降低,而体外试验中rPGRN可以促进自噬小体的形成并提高足细胞自噬流,流式细胞术结果显示自噬抑制剂3-MA可以降低PGRN对于足细胞的保护作用。基因沉默足细胞内PGRN的表达,发现可明显降低足细胞自噬流。IF结果显示PGRN的缺失造成p-AMPKα水平进一步降低,沉默AMPKα或者分别沉默AMPKα1和α2均可以降低PGRN对于自噬流的促进作用。在MPC中也同样证实了 PGRN对于自噬的促进作用。3.PGRN调控组蛋白去乙酰化酶Sirt1/PGC1α/FoxO1通路Sirt1对于线粒体生物合成功能和线粒体自噬都发挥着重要的调控作用,我们的结果发现,高糖条件下SIRTs家族Sirt1、Sirt3、Sirt4、Sirt6表达降低,而加入rPGRN可以特异性恢复Sirt1的蛋白水平。而在糖尿病肾病小鼠肾皮质中Sirt1表达水平降低,PGRN的缺失进一步降低Sirt1的表达水平。IP结果显示PGC1α乙酰化水平在高糖条件下升高,而加入rPGRN可以降低PGC1α的乙酰化水平。进一步我们发现PGRN也可以降低FoxO1的乙酰化水平。WB结果显示注射rPGRN可以恢复糖尿病肾病小鼠Sirt1、线粒体自噬相关蛋白PAKR2和线粒体生物合成蛋白PGC1α的表达水平。4.PGRN通过调控Sirt1改善线粒体稳态平衡4.1 PGRN通过Sirt1调控线粒体自噬:基因沉默Sirt1可以阻断PGRN对于FoxO1乙酰化水平的调控作用,进一步发现PGRN调控高糖条件下线粒体自噬相关蛋白PINK1和PARK2的表达,而免疫荧光结果显示Sirt1沉默可以阻断PGRN对于线粒体自噬小体的促进作用。4.2 PGRN调控线粒体生物合成:免疫沉淀结果显示沉默Sirt1可以阻断PGRN对于PGC1α乙酰化水平的调控作用。功能上沉默Sirt1可以阻断PGRN对于mtDNA的促进作用,以及降低PGRN对于线粒体膜电位的保护作用。流式细胞术结果显示沉默Sirt1减弱PGRN对于足细胞的保护作用。研究结论与创新性1首次证明了 PGRN通过促进线粒体自噬与线粒体生物合成,维持线粒体稳态,对病理条件下足细胞损伤发挥保护作用,为PGRN在糖尿病肾病等足细胞损伤相关疾病中的作用提供新的机制与思路。2阐明了 PGRN对于线粒体稳态调控的分子机制,发现PGRN通过调控Sirt1的表达从而影响PGC1α和FoxO1的乙酰化水平,进而调控PGC1α和PARK2的表达,最终影响线粒体的稳态平衡。3通过纯化rPGRN并进行糖尿病肾病小鼠模型的治疗研究,发现rPGRN可以通过维持糖尿病肾病小鼠足细胞线粒体稳态从而减轻足细胞损伤,为基于PGRN的足细胞损伤相关疾病临床治疗药物研发提供证据。