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猪链球菌（Streptococcus suis）是一种人兽共患病原菌,感染仔猪可导致患关节炎、败血症和脑膜炎等,对养猪业以及公共卫生均构成非常严重的威胁。目前,对猪链球菌病菌的防控主要依赖抗生素治疗,但抗生素的滥用,导致临床分离的多数病原菌株呈现严重耐药和多重耐药特性,细菌耐药问题日趋严重,阻碍了该病的有效防控,因此发掘新的抗菌制剂尤为重要;来源于噬菌体的裂解酶（Lysin）具有高效、快速杀菌,特异性强,且不易产生耐药性等特点,是一种潜在的新型抗菌制剂。本研究基于猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218在体外裂菌和在小鼠体内抗感染的良好效果,应用Ply5218对发病仔猪进行治疗。选用20 kg大小的仔猪,采取“颈部攻击-裂解酶治疗”策略,评价Ply5218的体内抗感染效果。将16只仔猪随机分成四组,分别为攻击未治疗组、未攻击治疗组,攻击后立即治疗组和攻击后延迟1 h治疗组。攻击组仔猪均经颈部肌肉注射10 mL（1.4×10100 CFU/mL）复壮的猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）强毒株HA9801,然后分别立即注射10 mL（512 U/mL）裂解酶Ply5218或PBS;延迟治疗组仔猪在攻击1 h后颈部注射10 mL（512 U/ml）的裂解酶Ply5218进行治疗,记录仔猪的的存活状态、体温、血液细菌载量以及血液中促炎性细胞因子水平。结果显示攻击后立即注射裂解酶Ply5218能够有效控制仔猪链球菌感染,立即治疗组存活率达到75%,而对照组存活率为0%;存活仔猪体温逐渐恢复正常;血液中细菌载量逐渐下降;立即治疗3天内,治疗组促炎性细胞因子表达水平显著低于未治疗组,且立即治疗仔猪健康状况逐步恢复至正常水平。为了使裂解酶Ply5218能更便捷地应用于临床治疗,本研究对其递送途径进行了探究。通过分析、优化Ply5218的密码子,将优化后的裂解酶基因片段克隆至真核表达载体PPlczA,在X33酵母感受态细胞中诱导表达,并对酵母表达条件进行优化,实现Ply5218高效、大批量表达;ICR小鼠经SS2 HA9801腹腔攻击后,分别进行X33-Ply5218(Ply5218在酵母细胞X33中表达)酵母细胞、Ply5218蛋白、X33酵母细胞对照及PBS缓冲液对照的口服治疗,分别于24 h、48 h、72 h及96 h测定每组小鼠血液、肝脏及脾脏的细菌数。结果显示:酵母表达Ply5218的最佳条件为:28℃、诱导48 h（每隔24 h加入1%的甲醇）;口服X33-Ply5218酵母细胞组和Ply5218蛋白组,小鼠体内的细菌数与对照组相比显著减少,说明小鼠口服X33-Ply5218和Ply5218能有效抑制猪链球菌在小鼠体内的增殖与感染。为了进一步鉴定猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218的最小活性功能域及关键氨基酸位点,便于后期对裂解酶的改造和降低表达成本,本文对全长裂解酶Ply5218和催化结构域(Ply52181-147)进行截短并对可能与活性相关的关键氨基酸位点进行定点突变,研究截短与突变后各个裂解酶蛋白的裂菌活性。通过与全长裂解酶蛋白裂菌活性的对比,确定Ply5218的最小活性功能域及关键氨基酸。结果显示:截短片段Ply52181-147可在平板上形成裂菌圈,仍保持裂菌活性,而比该片段更短的截短片段则失去裂菌活性,推测Ply52181-147为Ply5218的最小活性相关功能域;第8、第58、第136和第142位的氨基酸突变后,裂菌活性部分降低,而第34和第144位的氨基酸突变后,则彻底失去裂菌活性。提示这些位点的氨基酸与裂解酶的裂菌活性密切相关。综上所述,猪链球菌噬菌体裂解酶Ply5218,在仔猪遭受细菌攻击后立即注射治疗,能有效控制猪链球菌感染;经密码子优化后,裂解酶Ply5218能在酵母细胞X33中表达,攻击了猪链球菌HA9801的小鼠,通过口服X33-Ply5218酵母细胞治疗,组织中细菌载量显著下降,呈现一定的保护力;通过截短与定点突变,发现Ply5218发挥作用的最小功能域为Ply52181-147,鉴定了6个与裂菌活性相关的关键氨基酸位点,研究结果为深入揭示Ply5218的裂菌机制和进一步改造、应用裂解酶提供了基础数据。