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本试验在细胞水平和动物整体水平研究了黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEA)、呕吐毒素(DON)和伏马菌素B1(FB1)四种霉菌毒素对猪肾细胞、大鼠肝细胞和小鼠的联合毒性。(1)对猪肾细胞(PK15)的联合毒性将AFB1、ZEA、DON和FB1以不同浓度与PK15孵育12,24和48h后,采用MTT法和LDH释放法评价霉菌毒素的细胞毒性。结果表明：AFB1、ZEA、DON与PK15孵育48h后,EC50(50%效应浓度)分别为38.8、121.8和3.6μM,EC30(30%效应浓度)分别为26.9、86.6和1.8μm。且AFB1和ZEA均呈现时间效应和剂量效应关系,随着剂量增加和时间延长,霉菌毒素的细胞毒性增强。FB1浓度高达250μM且孵育48h后,PK15细胞活力仍大于70%。与霉菌毒素孵育24h后,AFB1、ZEA和DON能显著提高细胞LDH的释放,而FB1显著降低细胞LDH的释放。AFB1和DON均能显著提高细胞内活性氧和细胞凋亡率(P<0.05),而ZEA (10,20,40μM)对细胞内活性氧和细胞凋亡没有影响。四种霉菌毒素的细胞毒性大小顺序为DON> AFB1>ZEA>FB1。以每种霉菌毒素EC30作为中心点(其中FB1浓度为15μM),设计二元和三元混合,依据剂量和效应进行逐步回归得到拟合方程,根据拟合方程中各系数的含义表明：AFB1和ZEA(暴露48h)、AFB1和DON(暴露12h)、及ZEA和DON(暴露12和48h)对PK15的毒性表现为协同效应；AFB1和FB1联合作用仅表现AFB1的细胞毒性。AFB1、ZEA和DON三者联合作用12或24h后,AFB1与ZEA表现为拮抗效应。ZEA能缓解低浓度AFB1(1μM)诱导的细胞膜损伤和氧化损伤,但10μM ZEA与高浓度AFB1(5,10μM)能协同加剧细胞膜损伤和氧化损伤。10μMZEA主要能缓解由AFB1(1μM)诱导的细胞早期凋亡,可能是通过调控bcl-2和caspas-3及P53基因或蛋白的表达。(2)对大鼠肝细胞(BRL)的联合毒性将AFB1、ZEA、DON和FB1以不同浓度与BRL孵育12,24和48h后,采用MTT法和LDH释放法评价霉菌毒素的细胞毒性。结果表明：AFB1、ZEA、DON与BRL孵育48h后,ECso分别为37.9、100.3和13.3μM,EC30分别为29.2、91.6和3.27μM,160μM FB1基本不影响细胞活力。与霉菌毒素孵育24h后,AFB1、ZEA和DON能显著提高细胞LDH释放率,而FB1不影响细胞LDH的释放。AFB1和DON均能显著提高细胞内活性氧和细胞凋亡率(P<0.05),但ZEA (10,20,40μM对细胞内活性氧和细胞凋亡率没有影响。四种霉菌毒素对BRL的细胞毒性大小顺序为DON> AFB1>ZEA>FB1。以每种霉菌毒素EC30为中心点(其中FB1的浓度为15μM),设计二元和三元混合,根据剂量和效应进行逐步回归得到拟合方程,根据拟合方程中各系数的含义表明：AFB1和ZEA(暴露48h),及AFB1和DON(暴露12,24,48h)对BRL的毒性表现为协同效应；AFB1和FB1联合作用仅表现AFB1的毒性。AFB1、ZEA和DON三者联合作用12、24和48h,AFB1与DON表现为协同效应。AFB1与DON联合在细胞膜损伤和氧化损伤上表现为加型或协同效应。1μM AFB1与2μM DON联合能协同促进细胞凋亡,可能是通过降低bcl-2、促进bax和caspase-3及P53基因或蛋白的表达而促进细胞凋亡进程。(3)对Balb/C小鼠的联合毒性104只体重一致的4周龄雌性Balb/C小鼠适应一周后,随机分为13组,每组8只。具体分组如下：蒸馏水组、DMSO组、乙醇组、AFB1(2.5mg/kg.bw)、ZEA (5mg/kg.bw)、DON (5mg/kg.bw)、FB1(8mg/kg.bw)单一处理组及AFB1+ZEA、 AFB1+DON、AFB1+FB1、ZEA+DON、ZEA+FB1和DON+FB1联合处理组。联合组剂量采用单一剂量叠加,连续灌胃14d。霉菌毒素对Balb/C小鼠体增重不存在联合作用。FB1能显著提高脾脏重,含有FB1的联合组能减弱由FB1导致的脾脏增重。AFB1和DON能协同提高血清ALT活性和肝脏MDA含量,协同降低肝脏SOD活性,加剧小鼠肝脏细胞损伤和氧化损伤；AFB1与DON还能协同提高caspase-3和P53的表达来促进肝脏细胞凋亡。ZEA和DON不仅能协同提高血清中雌二醇含量,还能协同提高caspase-3基因的表达促进细胞凋亡。与单一处理相比,两两联合使小鼠肝脏HSP70蛋白表达进一步增加,表明联合作用使小鼠应激加剧。两两联合(AFB1、ZEA和DON)影响小鼠脾脏促炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α在]mRNA水平的表达,进而可能影响机体的免疫功能。通过上述试验结果可得出以下结论：(1)四种霉菌毒素对猪肾细胞和大鼠肝细胞的毒性趋势一致,大小依次为：DON>AFB1>ZEA>FB1。(2)霉菌毒素对细胞或机体的联合效应十分复杂,对不同的靶细胞或靶器官的效应不一致；AFB1与ZEA的联合作用方式与霉菌毒素的剂量呈依赖关系,ZEA能缓解低剂量AFB1造成的肾细胞毒性,但ZEA与高剂量AFB1呈现协同效应。(3)ZEA和DON两两联合导致小鼠脾脏促炎症因子的表达发生变化,可能影响脾脏的免疫功能。(4)AFB1和DON对大鼠肝细胞或小鼠肝脏损伤都体现为协同效应。