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研究背景：激素性股骨头坏死是骨科常见疾病,其致残率高,保守治疗效果欠佳。激素导致骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降是其中的一个重要机制。课题组前期通过microRNA芯片技术,筛选出激素性股骨头坏死患者与正常健康人骨髓间充质干细胞增殖分化过程中miRNA表达谱的差异特征,并将其与正常健康人骨髓间充质干细胞经大剂量激素刺激前后的miRNA表达差异谱进行比较,找到表达变化一致的miRNAs,为microRNA-23a,并进一步构建microRNA-23a mimics和inhibitor,进一步发现上调microRNA-23a可以导致骨髓间充质干细胞成骨分化减弱,下调microRNA-23a能够促进BMSC成骨分化。利用生物信息学分析结合双荧光素酶报告基因系统预测低密度脂蛋白相关蛋白5(low density lipoprotein receptor-related protein 5, LRP-5)为miRNA-23a的靶基因,使用shRNA沉默LRP5基因后可观察到BMSC成骨分化减弱,与上调miRNA-23a类似。激素性股骨头坏死坏死目前仍没有特效药物,研究发现,间断小剂量应用甲状旁腺激素能够促进成骨细胞生成,促进干细胞向成骨方向分化。人重组甲状旁腺激素[rhPTH (1-34)]是目前唯一批准上市的具有促进骨合成的抗骨质疏松药物,除治疗骨质疏松外,在促进骨折愈合、促进脊柱融合、促进软骨修复及下颌骨坏死都显示出了良好治疗效果。激素性股骨头坏死的发病机制包括激素抑制干细胞成骨分化,我们推测,人重组甲状旁腺激素[rhPTH(1-34)]是否也可以通过促进成骨细胞生成,促进干细胞向成骨方向分化的作用来治疗股骨头坏死。研究目的：1.构建microRNA-23a mimics和inhibitor,转染大鼠骨髓间充质于细胞。将转染成功的大鼠骨髓间充质干细胞注射至大鼠激素性股骨头坏死模型体内。评价microRNA-2 3a调控BMSC对大鼠股骨头坏死的修复作用。2.研究目前唯一的骨合成类抗骨质疏松药物特立帕肽对大鼠股骨头坏死的治疗作用。研究方法：1.第一部分：全骨髓贴壁培养法分离并培养大鼠骨髓间充质干细胞并进行鉴定。采用慢病毒法携带microRNA-23a mimics,inhibitor,vector转染大鼠骨髓间充质干细胞。使用脂多糖(LPS,20μg/Kg×2)联合大剂量甲强龙(40mg/Kg×3)的方法建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型。将miRNA-23a mimics, inhibitor, vector转染成功后的BMSC通过大鼠股骨髓腔注射的方法将干细胞悬液移植到大鼠激素性股骨头坏死模型体内。处死大鼠取大鼠股骨头行micro CT扫描及病理切片,观察股骨头坏死情况。免疫组化检测LRP-5在各组表达情况,观察股骨头坏死发生率和LRP5表达的差异。2.第二部分：首先应用脂多糖(LPS,20μg/Kg×2)联合大剂量甲强龙(40mg/Kg×3)的方法建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型。大鼠造模成功后,实验组给予人重组甲状旁腺激素[rhPTH (1-34)] 20μg/Kg每天皮下注射,对照组给予等量生理盐水,治疗4周处死大鼠,取大鼠静脉血行血清骨转换标志物骨钙素检测,取双侧股骨头行micro CT检查,观察股骨头坏死情况及分析骨小梁参数,行病理切片观察骨坏死情况。研究结果：1.采用全骨髓贴壁培养法可快速简便的分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,大鼠BMSC在体外可诱导成骨及成脂方向分化,流式细胞仪分析结果显示表面CD29,CD44,CD105,CD106 阳性, CD31,CD34,HLA-DR阴性。采用慢病毒法可成功转染大鼠BMSC。脂多糖(LPS,20μg/Kg×2)联合大剂量甲强龙(40mg/Kg×3)的方法可成功建立大鼠激素性股骨头坏死动物模型,造模成功率83%。Micro CT分析显示模型组股骨头出现囊变,骨小梁参数分析显示模型组骨小梁体积、骨小梁厚度等参数明显低于对照组。HE染色可观察到空骨陷窝形成、骨髓坏死、骨小梁断裂纤维组织修复。注射转染microRNA23a inhibitor BMSC组BV/TV、Tb.Th明显高于mimics组,而对照组介于两者之间,骨小梁数量及骨皮质厚度两组差异没有统计学意义。microPNA-23a mimics组股骨头坏死发生率明显高于inhibitor组(75%vs.18.2%,P=0.024),免疫组化显示microRNA-23a mimics组LRP5表达低于inhibitor组。2.人重组甲状旁腺激素[rhPTH(1-34)]20μg/Kg×28天治疗组股骨头坏死率为16.7%(2/12),对照组股骨头坏死率为75%(9/12),两组差异有统计学意义。(P<0.05),骨小梁参数定量分析显示BV/TV、Tb.Th、BMD治疗组明显高于对照组。结论：1.microRNA-23a在大鼠体内能够调控BMSC成骨分化能力,从而对大鼠激素性股骨头坏死呈现不同程度的修复效应。抑制microRNA-23a,股骨头坏死发生率降低,骨小梁参数BV/TV、Tb.Th升高,LRP5表达升高,micRNA-23a表达升高则呈现相反的效应。2.人重组甲状旁腺激素[rhPTH (1-34)]20μg/Kg×28天皮下注射能够降低大鼠激素性股骨头坏死率,提高骨小梁体积等相关参数。