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N-糖基化修饰是最为常见也是最为复杂的一种翻译后修饰手段,对于调节蛋白质的结构和功能具有重要的作用。肠激酶作为一种具有高度特异性的异源二聚体蛋白酶,是基因工程领域常用的工具酶。本文在实现牛肠激酶轻链可溶性表达的基础上,首次利用定点突变的手段研究毕赤酵母N-糖基化修饰对于牛肠激酶酶学性质的影响。首先,本研究使用Endo H酶对重组野生型牛肠激酶轻链进行去糖基化处理,发现在毕赤酵母中表达的牛肠激酶轻链是N-糖基化修饰蛋白。基因序列研究发现,在牛肠激酶轻链的一级结构中含有三个潜在的糖基化位点N64、N103以及N165,且都位于肠激酶外部的无规则卷曲部位。继而,利用基因工程手段,构建N-糖基化缺失程度不同的去糖基化突变牛肠激酶重组菌株,包括单点突变N64Q、N103Q、N165Q,双点突变MD1、MD2、MD3以及三点突变MT,获得经SDS-PAGE检测条带单一的去糖基化突变牛肠激酶。接着,对比野生型及去糖基化突变牛肠激酶的生物化学性能,发现去糖基化修饰对牛肠激酶在毕赤酵母GS115中的分泌表达没有影响,但是对于酶的活性有重要意义。在以GD4K-β-na为底物时,突变体N64Q提高了牛肠激酶的比活且提高了酶的催化效率。与野生型牛肠激酶相比,去糖基化牛肠激酶的热稳定下降且其下降程度与去糖基化程度有关,完全去糖基化突变体MT表现出最低的热稳定性。另外,研究发现去糖基化突变对牛肠激酶的二级结构没有影响,但是会改变牛肠激酶的三级结构。本实验成功构建了N-糖基化缺失位点不同且程度各异的牛肠激酶轻链表达菌株,并研究了N-糖基化这一翻译后修饰手段对于牛肠激酶分泌、活性、稳定性等酶学性质的影响。本实验的研究成果为揭秘糖基化密码提供了一定的理论基础,同时该策略为研究其它工具酶的翻译后修饰提供了可借鉴的思路。