论文部分内容阅读
禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi（L.）属于半翅目Hemiptera、蚜科Aphididae,是重要的小麦害虫之一,在我国及世界各小麦种植区均广泛分布。该虫不但直接刺吸危害小麦,而且传播大麦黄矮病毒,每年给小麦生产造成重大经济损失。禾谷缢管蚜的防治主要依靠化学防治,而杀虫剂的不合理使用已经导致该虫对多种不同类型杀虫剂产生了抗药性。细胞色素P450酶系和羧酸酯酶酶系是昆虫体内两类关键解毒酶系,在昆虫对杀虫剂的解毒代谢过程中起着重要作用。目前,细胞色素P450和羧酸酯酶介导的禾谷缢管蚜抗性机制鲜有报道。本研究利用禾谷缢管蚜基因组数据,系统解析禾谷缢管蚜P450基因的序列信息,研究P450基因在异丙威抗性品系中的表达变化和应对异丙威刺激的响应;运用RNAi研究抗性相关的P450基因在异丙威等杀虫剂抗性中的作用;克隆获得CYP6CY3-3这一新的CYP6CY3基因簇基因,分析禾谷缢管蚜吡虫啉抗性品系和敏感品系间CYP6CY3-3基因表达差异,并从转录水平上探讨CYP6CY3-3基因表达的调控机制;首次克隆获得禾谷缢管蚜细胞色素P450还原酶基因序列,分析RpCPR与该虫对异丙威和吡虫啉抗性的关系,检测RpCPR在禾谷缢管蚜田间个体中的多态性;研究羧酸酯酶在禾谷缢管蚜对异丙威和氯氟氰菊酯抗性中的作用。本研究结果对于系统分析禾谷缢管蚜代谢抗性机理具有重要意义,并对制定该虫的抗性治理与综合防治策略具有重要的指导意义。主要研究结果如下:一、禾谷缢管蚜P450基因的鉴定、克隆及其在异丙威抗性中的作用利用公共数据库中的禾谷缢管蚜基因组数据,根据序列注释和P450保守结构分析,获取初始禾谷缢管蚜P450基因序列信息;然后通过序列多重比较和手工注释,共鉴定禾谷缢管蚜P450基因54条。这54条P450基因分布于4个集团9个家族17个亚家族中,其中CYP2、CYP3、CYP4和mitochondrial集团分别有9个、24个、15个和6个P450基因。经RT-PCR成功扩增了50个P450基因,Rpa00969和Rpa18866经多对引物PCR扩增均未获得,Rpa00968、Rpa16802和Rpa16803测序结果表明为同一P450基因。生物测定结果显示本实验室建立的禾谷缢管蚜异丙威抗性品系（IS-R）相对于敏感品系（SS）对异丙威产生32.4倍抗性,IS-R品系对氨基甲酸酯类杀虫剂灭多威、克百威和茚虫威分别产生12.56倍、8.74倍和6.07倍的交互抗性。P450酶活力测定表明抗性品系中P450酶活是敏感品系中的1.78倍,表明P450在禾谷缢管蚜异丙威抗性中起着重要作用。通过qPCR分析CYP3和CYP4集团P450基因在抗异丙威品系和敏感品系中的表达差异,结果表明CYP6CY7、CYP6CZ1和CYP4CJ1三个P450基因表达差异显著。进一步探究上述三个P450基因对异丙威处理的响应,利用LC25、LC50和LC75浓度的异丙威分别对抗性品系和敏感品系进行处理。qPCR结果显示在不同浓度的异丙威处理无翅成蚜24 h后,CYP4CJ1基因在禾谷缢管蚜敏感品系和抗异丙威品系中均显著诱导上调表达。通过注射dsCYP4CJ1干扰该基因表达,结果发现CYP4CJ1基因在注射dsRNA48 h后的表达量下降36.33%;利用LC50浓度的异丙威、灭多威、克百威和茚虫威分别处理禾谷缢管蚜,与注射dsGFP的对照组相比,注射dsCYP4CJ1 24 h后各农药处理组的死亡率分别提高34.12%、23.05%、26.87%和30.58%,表明该基因参与禾谷缢管蚜对异丙威的抗性。二、禾谷缢管蚜P450 CYP6CY3-3基因的克隆和转录调控机制研究克隆获得新的禾谷缢管蚜CYP6CY3-3基因,氨基酸序列分析显示,CYP6CY3-3与本研究组之前报道的CYP6CY3-1和CYP6CY3-2共同组成了禾谷缢管蚜CYP6CY3基因簇。qPCR结果显示禾谷缢管蚜吡虫啉抗性品系中CYP6CY3-3基因在转录水平上显著上调表达。为分析CYP6CY3-3在转录水平上的调控机制,以禾谷缢管蚜敏感品系（SS）和吡虫啉抗性品系（IM-R）基因组DNA为模板,通过基因组步移技术获得CYP6CY3-3基因的5′侧翼区序列。对两个品系的单个个体进行测序分析,发现IM-R品系的CYP6CY3-3基因的5′侧翼区序列多样性显著低于SS品系。转录因子结合位点预测分析发现5′侧翼区存在多个转录因子结合位点。利用双荧光素酶报告系统对CYP6CY3-3 5′端不同区段进行启动子活性分析,发现-1044/-757区段在调控CYP6CY3-3基因表达方面起着重要作用。三、禾谷缢管蚜NADPH-细胞色素P450还原酶基因克隆、抗性品系中的表达模式和田间种群多态性研究NADPH-细胞色素P450还原酶（CPR）是所有微粒体型P450基因唯一电子传递者,在P450代谢活力调控中起重要作用。本研究通过RACE技术成功克隆禾谷缢管蚜CPR基因（RpCPR）,氨基酸序列分析发现RpCPR含有FMN、FAD及NADPH保守功能区域,与豌豆蚜CPR基因的亲缘关系最近。RpCPR基因在禾谷缢管蚜不同发育阶段表达水平不同,在2龄若虫中表达量最高,在成虫中表达水平最低。RpCPR基因在IS-R和IM-R品系中表达量分别为敏感品系SS中表达量的3.74和3.52倍。利用LC30浓度的异丙威和吡虫啉分别处理禾谷缢管蚜敏感品系,在LC30异丙威诱导下,RpCPR转录本上调表达1.66-2.18倍;在LC30吡虫啉诱导下,RpCPR基因表达量于3 h上调至1.85倍,在6 h达到2.08倍,在12 h和24 h分别为对照的1.16倍和1.19倍。RpCPR与禾谷缢管蚜对吡虫啉和异丙威的抗性存在相关性。对采自我国11个地区的禾谷缢管蚜地理种群的167个个体的RpCPR序列进行克隆测序分析,这些个体的RpCPR基因共存在334个核苷酸多态位点,共146个单倍型。其中65个多态位点在2个以上个体中被检测到,A627T、G1362A、C1450T和A1536T四个核苷酸多态位点在31.7%、35.3%、35.3%和30.5%的个体中被发现。RpCPR的氨基酸序列存在194个错义突变位点,其中21个突变位点为简约性信息位点,P484S位点在11个地理种群共59个个体中发现。四、羧酸酯酶在禾谷缢管蚜抗异丙威和氯氟氰菊酯中的作用酶活分析显示禾谷缢管蚜抗异丙威品系（IS-R）和抗氯氟氰菊酯品系（CY-R）的羧酸酯酶活性显著上调,分别为敏感品系（SS）的2.20倍和2.05倍,表明禾谷缢管蚜羧酸酯酶与异丙威和氯氟氰菊酯抗性相关。利用本课题组已有的禾谷缢管蚜转录组数据获得7个禾谷缢管蚜羧酸酯酶基因。qPCR结果显示CL2102基因在IS-R和CY-R中的表达量均显著上调,分别为SS的4.99倍和2.73倍,因此进一步对CL2012基因进行深入分析。通过RACE技术克隆获得CL2012 cDNA全长序列,命名为RpCarE（GenBank登录号:MH561903）。同源进化分析发现RpCarE在氨基酸水平上与桃蚜酯酶FE4、豌豆蚜酯酶FE4、大豆蚜羧酸酯酶和棉蚜羧酸酯酶存在较高的相似性。序列分析表明RpCarE保留羧酸酯酶典型催化三联体（S185-H432-E312）。利用大肠杆菌表达系统对RpCarE进行原核表达,以获得体外重组蛋白并进行功能研究。纯化的RpCarE蛋白对模式底物α-NA具有较强的亲和力,能很好地结合底物,Kcat/Km为0.13μM-1·s-1,表明经由原核表达系统获到的RpCarE纯化蛋白为具有水解活性的羧酸酯酶。利用HPLC测定RpCarE重组蛋白对异丙威和氯氟氰菊酯两种农药的水解活性,发现该蛋白对两种农药均有显著代谢活性。利用SYBYL X2.0软件完成RpCarE与异丙威和氯氟氰菊酯对接模型,分子对接结果显示异丙威和氯氟氰菊酯农药分子可以很好地定位于RpCarE的活性口袋,并与催化三联体（S185-H432-E312）紧密相关。