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自核移植工作开创以来，克隆胚中供体核的再程序化以及核质互作的问题就一直是发育生物学关注的焦点之一。人们认为自己可以通过克隆手段“复制”一个在遗传物质上与成体动物完全一致的个体，然而受体细胞质在遗传(线粒体基因组)和性状(早期图式形成)上或多或少地影响着克隆个体。虽然在不同物种中都有克隆成功的报道，但克隆的低成功率和成功克隆个体的早衰、发育缺陷等问题尚没有得到有效解决。影响动物克隆成功的关键因素——移植核的再程序化问题始终困扰和吸引着克隆领域的研究者，并成为动物克隆研究领域的热点和难点。另一方面，异种间的克隆能够突破不同物种间的生殖隔离障碍，为拯救濒危动物提供了一条全新的途径，同时也为核质关系研究提供了新的模型。中国学者童第周等在鱼类的克隆，特别是鱼类异种间克隆的开创性研究和卓越贡献奠定了中国在动物克隆研究领域的国际地位。
本实验室从上个世纪末开始致力于鱼类核移植工作的研究。受试的鱼类从经济淡水鱼鲤鱼，鲫鱼等逐渐转移到模式鱼斑马鱼，稀有鮈鲫。相对于同种克隆，种间克隆的成功率要降低许多，而影响种间克隆成功率的因素除了“供体细胞核的再程序化”外，更重要的是“异种间细胞核质的互作”。同咱克隆是研究前—命题的有力途径，而种间克隆一直被认为是研究后一命题的有效手段。显然，以种间克隆进行核质关系的研究实际上是将这两个命题置于同一研究体系，这样并不利于对这两个命题特别是后一命题的独立分析。在本研究中，本文作者利用两种实验鱼——斑马鱼和稀有觞鲫，通过对此两种鱼进行正反向有性杂交得到具有相同细胞核遗传物质而不同卵质的有性杂交胚胎，由于在这两种胚胎中，并不存在细胞核的再程序化事件，因而提供了研究种间核质互作的良好模型。本文作者利用此材料开展了关于异种间细胞质和细胞核间的相互作用及杂交胚胎中基因表达差异的研究。另一方面，鉴于在此前的研究中，本实验室所获得的由转基因鲤鱼细胞核和金鱼去核卵配合的属间克隆鱼的体节发育进程和脊椎骨数目均与受体金鱼一致，而迥异于供体鲤鱼，本研究开展了体节特异荧光蛋白基因(GFP)转基因鱼的研究。
主要内容包括：
1.利用cDNA-AFLP技术，分别比较分析了斑马鱼稀有鮈鲫正反杂交胚胎50％外包，90％外包时期部分基因的差异表达。将两个时期的正反杂交胚胎提取RNA合成cDNA建立4个cDNA池，分析64对引物组合获得13000条带，所有TDFs经过斑点杂交筛选，荧光定量分析，共鉴定25条带具有差别表达，均为量的差异，其中在ZR(Zebrafish♀×Rare minnow♂，ZR)中上调表达的有12条，RZ(Rare minnow♀×2ebrafish♂，RZ)中上调表达的13条。将差异条带进行克隆测序，BLAST分析结果表明除了未知的13条片段外已知的序列功能涉及比较广泛，其中包括线粒体蛋白，RNA假尿苷的合成，线粒体16S核糖体基因，糖基转移酶，III类组织相容性抗原，可溶性的神经因子，Huntington疾病基因等。通过cDNA-AFLP所筛选出的差异片段，对其进行荧光定量分析，胚胎原位杂交分析。结果显示片段的差异大多集中在5-10倍的范围。对于未知功能的基因片段合成反义RNA进行胚胎原位杂交。杂交结果显示，所有基因片段均为泛组织表达。
2.利用cDNA-AFLP技术筛选斑马鱼稀有鮈鲫相互杂交胚胎50％外包，90％外包时期部分基因的差异表达。从中选择两个克隆cDNA，以进行深入的功能研究。获得两个基因ZR6和RZ10的编码区，将其体外转录为成熟mRNA，进行显微注射过表达分析。ZR6的过量表达导致胚胎发育呈现一定的表型而RZ10的过量表达没有产生变化。ZR6过表达的表型类似于BMP拮抗因子Chordin的过表达表型，即胚胎发育的背部化(dorsalization)，选择若干背腹模式相关的标记基因进行原位杂交分析，揭示ZR6过表达所致的表型为背部化。由ZR6 cDNA序列所推定的蛋白序列和结构分析提示其为一个锌指蛋白，并行使转录抑制的功能。将ZR6基因的DNA结合域分别与vp16转录激活功能域和engrailed转录抑制功能域连接，构建融合基因vp16-ZR6和eng-ZR6，体外合成mRNA显微注射进行功能验证，结果显示转录抑制型eng-ZR6过表达产生类似于野生型ZR6过表达的表型，而转录激活型vp16-ZR6过表达导致类似于ZR6反义morpholino注射后的表型。进一步的研究表明，ZR6过表达所导致的背部化表型可以被bmp2b的过表达所拯救甚至反转为腹部化表型。总之，本研究发现了一个新的锌指蛋白ZR6，其行使转录抑制因子的功能，并直接或间接地参与BMP通路并调控斑马鱼背腹轴的形成。
3.通过基因组信息学分析，快速分离克隆斑马鱼Lfng基因的上游调控序列，并将5’方向长度不同的3个上游调控序列分别与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein，gfp)连接，构建表达载体pLfngEGFPa、pLfngEGFPb、pLfngEGFPc。对斑马鱼胚胎的转基因发现，包含有GC-box，CAAT-box和TATA-box的0.2kb的上游片段已经能够驱动GFP的组织特异性表达，但长度为0.4kb和1.2kb的上游片段所具有的启动活性更高。这表明斑马鱼Lfng启动子的关键调控序列在其5’端非编码区上溯到200bp以内，而200bp-400bp之间包含有增强调控序列。筛选获得半合子的Lfng GFP转基因斑马鱼，并观察到组织特异性绿色荧光蛋白的表达。进一步研究发现，斑马鱼胚胎自1-胞期开始已能检测到Lfng的mRNA信号，Lfng-GFP转基因雌性个体的后代自1.胞期始便能观察到GFP基因的表达。这表明斑马鱼Lfng为斑马鱼卵细胞中携带的母性因子之一，提示鱼类的体节发育受到母性因子的控制。
4.通过基因组信息学分析，快速分离克隆斑马鱼her6基因的上游调控序列，并将5’方向长度不同的3个上游调控序列分别与gfp连接，构建表达载体pher6EGFPa、 pher6EGFPb、pher6EGFPc。对斑马鱼胚胎的转基因发现，包含有CAAT-box，CCAAT- box，SPS sequence和TATA-box的0.5kb的上游片段是能够正常驱动GFP的组织特异性表达的最短片段，而长度为0.2kb只包括部分SPS sequence和TATA-box的上游片段只能表达出极微弱的绿色荧光。转基因胚胎自囊胚期到尾芽期基本看不出明显的组织特异性绿色荧光蛋白的表达。从尾芽期开始，非常明显的分割图式已可以观察到，特异的GFP表达在后面发育时期依然可以持续观察到。它可以在头部包括眼睛，脑区等，每个体节的后半部分，脊索，肌肉，前体节中胚层(pre-somiticmesoderm，PSM)都可以很明显的观察到。