目的:大肠癌是全世界第三大常见的恶性肿瘤,对人类的健康构成极大的危害,因此研发有效药物迫在眉睫。研究表明寒热错杂是形成多种消化道恶性肿瘤的主要病机,寒热并用、辛开苦降、调畅气机等疗法治疗消化道恶性肿瘤有确切疗效。小柴胡汤是典型的寒热并用的经典方,大量研究已经证明,小柴胡汤对多种癌有抑癌作用,亦发现小柴胡汤对大鼠结肠癌有抑制作用。但目前尚未从寒热并用角度研究小柴胡汤抑癌作用机制。碱性磷酸酶和脂质是细胞膜主要成分,与细胞的命运密切相关,最近已成为新的研究热点,本研究基于碱性磷酸酶、脂质和脂质过氧化及其与癌细胞的增殖和凋亡的关系,探究小柴胡汤及其寒热减方对结肠癌细胞的影响及其机制,以及小柴胡汤寒热并用组方机制。方法:本研究设置1个阴性对照组:未加药处理的HCT116细胞组(在本文中都用“HCT116细胞组”表述);5个实验组(中药组):小柴胡汤组、小柴胡汤去柴胡组、小柴胡汤去黄芩组、小柴胡汤去半夏组、小柴胡汤去生姜组,中药各组分三个浓度,即0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml;1个阳性对照组即秋水仙碱组,三个浓度为1.0mmol/L、2.5mmol/L、10mmol/L,分别采用上述药物及浓度处理HCT116细胞。MTT法检测培养24h、48h、72h细胞的增殖活力。苏丹红Ⅳ染色法和显微镜下计数观察各组HCT116细胞脂肪积累。采用碱性磷酸酶试剂盒、热稳定实验及抑制实验探究中药组对HCT116细胞碱性磷酸酶及其同工酶的影响。用硫代巴比妥酸法和紫外分光光度法检测HCT116细胞脂质过氧化产物丙二醛和共轭二烯,探究中药组对HCT116细胞脂质过氧化的影响。采用丫啶橙/溴乙锭双染法观察中药组对HCT116细胞凋亡的影响。结果:1.细胞增殖活力结果:中药组显著抑制细胞增殖活力,随着作用时间的延长和浓度的增加,细胞增殖活力进一步降低(P<0.01),小柴胡汤组在72 h的细胞增殖活力半抑制浓度(IC50)最低,为1.0 mg/ml,其余四组中药组IC50均为1.5mg/ml。2.细胞脂肪累积结果:2.1苏丹红Ⅳ染色结果:中药组脂肪累积较为加药HCT116细胞组少。小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组脂肪累积最多,小柴胡汤去柴胡组和小柴胡汤去黄芩组次之,小柴胡汤最少。秋水仙碱组的癌细胞没有明显脂肪堆积,癌细胞存活显著下降,且随着浓度的增加,细胞数量急剧下降或消失。2.2脂肪累积细胞百分数结果:与未加药HCT116细胞组比较,五组中药组脂肪累积细胞百分数较低(P<0.01)。小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组脂肪累积细胞百分数较高(P<0.01),小柴胡汤去柴胡组和小柴胡汤去黄芩组脂肪次之,小柴胡汤组最低。3.细胞碱性磷酸酶及其同工酶的结果3.1热稳定性实验和IAP特异抑制剂L-苯丙氨酸抑制实验结果显示:在细胞内,五组中药组IAP酶活性高于未加药HCT116细胞组(P<0.01)。小柴胡汤去黄芩组IAP酶活性最高(P<0.01),小柴胡汤去柴胡组次之,小柴胡汤组较低,小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组IAP酶活性最低。各组细胞内TNAP酶活性显著低于IAP酶活性,除小柴胡汤去黄芩组TNAP酶活性偏高外,其余组间细胞内TNAP酶活性无显著差异。在培养液中,五组中药组TNAP(除小柴胡汤组和小柴胡汤去柴胡组无意义)和IAP酶活性均高于未加药HCT116细胞组(P<0.01)。小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组培养液中TNAP活性最高(P<0.01),小柴胡汤去柴胡组和小柴胡汤去黄芩组次之,小柴胡汤组最低。各组TNAP酶活性均显著高于IAP酶活性,五组中药组IAP酶活性无显著差异。3.2碱性磷酸酶染色结果:未加药HCT116细胞组颜色最淡,其次小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组,然后是小柴胡汤组,小柴胡汤去黄芩组和小柴胡汤去柴胡组颜色最深(碱性磷酸酶含量最多)。这与碱性磷酸酶定量结果吻合。4.小柴胡汤及其寒热减方对HCT116细胞脂质过氧化结果:4.1丙二醛检测结果与未加药HCT116细胞组比较,五组中药组细胞内丙二醛含量显著降低,差异有显著意义(P<0.01)。与小柴胡汤组比较,其余四组中药组丙二醛含量较高,且有统计学意义(P<0.01);与小柴胡汤去柴胡组比,小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组细胞内丙二醛含量较低(P<0.05)。与小柴胡汤去黄芩组比较,小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组细胞内丙二醛含量较低,差异有意义(P<0.05)。在培养液中各组的丙二醛含量没有明显差异。4.2共轭双烯检测结果未加药HCT116细胞组与五组中药组细胞内共轭双烯含量没有明显差异。在培养液中,小柴胡汤去柴胡组、小柴胡汤去半夏组和小柴胡汤去生姜组培养液中共轭双烯含量较高,HCT116细胞组次之,小柴胡汤组和小柴胡汤去黄芩组最低。5.细胞凋亡结果:5.1染色结果与未加药HCT116细胞组比较,五组中药组细胞呈现明显凋亡表现:五组中药组细胞凋亡情况比较:小柴胡汤组较其余四组中药组凋亡表现更为明显。5.2细胞凋亡百分数结果与未加药HCT116细胞组比,五组中药组细胞凋亡百分数高(P<0.01);与小柴胡汤细胞凋亡百分数(83.33%)比,其余四组细胞凋亡百分数较低;小柴胡汤去柴胡组(67.33%),小柴胡汤去黄芩组(66.67%),小柴胡汤去半夏组(69%)小柴胡汤去生姜组(70%),四组间无明显差异且无统计学意义。6.脂肪累积、碱性磷酸酶、脂质过氧化与增殖和凋亡的相关性6.1脂肪累积与增殖和凋亡的相关性脂肪累积与HCT116细胞增殖呈正相关(P<0.01),与HCT116细胞凋亡呈负相关(P<0.01)。6.2碱性磷酸酶与增殖和凋亡的相关性在HCT116细胞中,IAP与HCT116细胞增殖呈负相关,与HCT116细胞凋亡呈正相关;TNAP与HCT116细胞增殖,凋亡相关性不强;在HCT116细胞的培养液中,IAP与HCT116细胞增殖呈负相关(P<0.01),与HCT116细胞凋亡呈正相关(P<0.01);TNAP与HCT116细胞增殖和凋亡(P<0.05)的相关性不强。6.3脂质过氧化与增殖和凋亡的相关性在HCT116细胞中,丙二醛与HCT116细胞增殖呈正相关,与HCT116细胞凋亡呈负相关;共轭双烯与HCT116细胞增殖,凋亡相关性不强。在HCT116细胞的培养液中,丙二醛,共轭双烯与HCT116细胞增殖,凋亡的相关性不强。结论:1.小柴胡汤及其寒热减方通过抑制脂肪累积和脂质过氧化,促进IAP活性,抑制HCT116细胞增殖,促进HCT116细胞凋亡;2.小柴胡汤寒药减方更明显促进IAP活性和抑制脂肪累积,小柴胡汤热药减方更明显抑制脂质过氧化;3.小柴胡汤及其寒热减方均抑制HCT116癌细胞增殖,促进HCT116癌细胞凋亡,小柴胡汤寒热并用全方作用最强;4.小柴胡汤中寒药和热药并用,分别作用于TNAP和IAP,调节脂肪转运代谢,降低脂质过氧化水平,抑制结肠癌细胞增殖,促进结肠癌细胞凋亡。