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研究背景:蚊媒传染病(Mosquito-borne diseases,MBDs)是一类由病媒蚊虫传播的自然疫源性疾病,常见的有疟疾、登革热、基孔肯雅热等,传播力强,流行广,发病率高,其防制的主要手段是化学防制。然而,随着化学杀虫剂的大量使用,蚊虫的抗药性日益升高,严重污染环境,危害人类健康。蚊浓核病毒(Mosquito densovirus,MDV)属于特异性病原体病毒,特异性感染蚊类,在自然界中可以水平传播和垂直传播。但是过去主要利用蚊虫细胞系富集病毒,生产流程相对复杂,成本昂贵,因此迫切需要发展一种经济、快速生产大量MDV的方法。环状RNA(circular RNA,circRNA)是一类新发现的不具有5’帽子和3’ poly(A)尾巴、形成共价闭合环形结构的非编码RNA,具有高度保守性,存在疾病、组织及不同发育阶段的表达特异性。大部分circRNA在细胞质中富集,不易被核酸外切酶降解,稳定性更高,因此,circRNA可以作为新型临床诊断标记物,在各种生物学功能中发挥重要作用,但在蚊虫中尚未进行研究。目的:1.MDV在蚊媒疾病防制中具有巨大潜能,探索一种经济、快速、商业化生产MDV的方法。2.通过对白纹伊蚊circRNA的预测与鉴定,进一步了解蚊虫circRNA的作用与机制,为其他昆虫circRNA的研究提供基础,为蚊虫防控提供新的思路。方法:1.采用两种野生型(wt)MDV(Aedes aegypti densovirus,AaeDV和Aedes albopictus densovirus-3,AalDV-3)以及重组型 MDV(Recombinant Aedes aegypti densovirus-210,rAaeDV-210)分别感染埃及伊蚊Aag2细胞系和白纹伊蚊C6/36细胞系及1-2龄和3-4龄白纹伊蚊、埃及伊蚊和致倦库蚊幼虫,评估细胞、培养基上清、幼虫和饲养水体中MDV的滴度、病毒产量和总病毒产量。2.收集羽化4 d后30只未交配、未吸血的雌性和雄性白纹伊蚊成蚊采用高通量RNA测序技术预测出白纹伊蚊体内的circRNA,并通过RT-PCR、qPCR验证高含量的circRNA。结果:1.在不同细胞中,三种病毒在C6/36细胞中的总最大病毒产量高于Aag2细胞;在同一细胞中,在细胞内的最大病毒滴度高于培养基上清。在不同蚊虫中,伊蚊的最大病毒产量高于库蚊;在同一种蚊虫中,1-2龄幼虫的病毒滴度高于3-4龄幼虫,幼虫体内的病毒滴度高于饲养水体中的滴度。重组病毒的产量高于野生型病毒。且利用200 mL水饲养100只1-2龄伊蚊幼虫,可获得1013基因组当量(Genomic equivalent,GEQ)的 MDV 产量。2.预测出1531个circRNA,长度约200-1000 nt,来源于外显子-外显子,外显子-基因间,基因间-外显子,基因间-基因间,其中以基因间-基因间circRNA最丰富。鉴定出雌性高表达circRNA103个和雄性高表达circRNA1 83个。在雌蚊和雄蚊含量(reads数)最高的前20位circRNA中,选取雌雄蚊共有的10个circRNA,通过RT-PCR、qPCR验证,证实测序数据的可靠性。结论:1.利用蚊虫体内方法生产MDV可以以较低的生产成本获得更高浓度、更大总量的MDV。该体内方法在MDV的大规模商业化生产中具有巨大的潜力。2.使用高通量测序在白纹伊蚊中鉴定出了 1531个circRNA,将circRNA分为4种类型,通过逆转录PCR、qPCR验证circRNA的存在,为进一步研究蚊虫中的circRNA奠定了基础。