论文部分内容阅读
各种因素所致的慢性肝脏损伤,都可能发生肝细胞炎症、坏死,进而发展成为肝纤维化或肝硬化,治疗上目前尚无理想的治疗方法。肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor HGF)作为一种多功能生长因子,是由肝脏的储脂细胞生成的一种具有强烈有丝分裂原活性的蛋白质,它不仅能够刺激原代鼠肝细胞DNA的合成,参与多种细胞的增殖、迁移和形态发生,对多种成熟的器官/组织有营养修复作用,促进肝、肾、肺等损伤器官的再生,而且对各种因素引起的肝纤维化具有良好的拮抗和治疗作用。因此,应用HGF治疗各种慢性肝损伤、肝纤维化也是明智的选择。虽已应用于临床,其来源主要是从人血浆、胎盘、或动物的胎肝中提取纯化,是单链pro-HGF与异二聚体HGF的混合物,费时、费力、活性差、成本昂贵、体内半衰期短,需要反复应用才维持体内血药浓度,采用基因治疗的方法或利用基因工程表达重组人HGF是大量获取具有生物学活性HGF的有效途径。为此,我们构建了携带人HGF全长基因片断的真核表达质粒,建立了转染PCI-new-HGF/HL-7702细胞、转染PCI-new-HGF/CFSC-2G细胞模型和大鼠肝纤维化模型,测定其转染肝细胞后的生物学效应。并在建立大鼠肝纤维化模型上观察其在体内的作用,为进一步证实HGF的生物学效应提供了理论依据和实验依据。有研究报道HGF可抑制转移生长因子β(Transforming growth factor TGF-β)基因的转录水平,促进肝细胞增殖和细胞增殖核抗原(PCNA)的表达,从而抑制星状细胞的激活,降低肌成纤维细胞α-肌动蛋白(α-smooth muscle actinα-SMA)的表达,但目前尚没有HGF对肝细胞凋亡、肝星状细胞凋亡的研究,为探讨HGF对肝细胞、HSC的作用及机制,我们还用PCI-neo-HGF转染了人正常肝细胞株(HL-7702)、大鼠星状细胞株(CFSC-2G)。采用CCl4诱导HL-7702细胞的凋亡,刺激CFSC-2G细胞株,观察HL-7702细胞、CFSC-2G细胞的caspase-3、caspase-8、caspase-9蛋白的表达,结果显示CCl4损伤后转染PCI-new-HGF的HL-7702细胞后,caspase-3蛋白表达量较CCl4损伤/HL-7702细胞、PCI-neo/HL-7702细胞明显降低,caspase-8、caspase-9没有变化;转染PCI-neo-HGF/CFSC-2G细胞caspase-3蛋白表达量较CCl4诱导的CGFS-2G增加,且检测到caspase-9,提示PCI-neo-HGF转染HL-7702细胞后,能够对抗CCl4损伤人肝细胞(HL-7702)的凋亡。而拮抗CCl4诱导的HL-7702细胞的凋亡的作用很可能是通过下调caspase-3蛋白表达途径实现的;PCI-neo-HGF促进大鼠CFSC-2G细胞的凋亡,其可能的作用机制与上调caspase-3、-9蛋白表达有关。应用HGF基因对模型鼠进行抗纤维化的体内研究,结果显示经过PCI-neo-HGF质粒转染的实验鼠治疗组,预防给药组、治疗1组,纤维组织增生较模型对照组减轻,假小叶形成率低,且程度轻,未见典型的假小叶,肝细胞脂肪变性也较模型对照组减轻,炎性细胞浸润较空载质粒组明显减轻,预防给药组、治疗1组的部分大鼠肝病理变化不明显,接近正常肝组织,接近丹参治疗组。相比较治疗1组而言,预防给药组纤维组织增生较少,局限于汇管区,以肝细胞脂肪变性为主,假小叶形成率较低,且全部成活。提示经过PCI-neo-HGF质粒转染对有一定的保护肝细胞、抗肝纤维化的治疗作用,值得进一步研究。为进一步的临床使用提供了重要的理论基础、技术路线和实验方法。