论文部分内容阅读
免疫荧光测定法(immunofluorescence assay，IFA)在医学和生物学研究中的应用已有近60年的历史，其原理就是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合，以荧光物质标记抗体，对组织或细胞内的抗原物质进行定位检测。然而，传统荧光染料在荧光显微镜激发光照射下易发生光漂白现象，而且传统抗体制备及标记方法易降低抗体效价并产生非特异性染色。因此开发新的荧光标记物及标记方法是很有意义的。近年来，关于绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)融合单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)检测相应抗原的报道很多，但每检测一种抗原就要制备相应的融合抗体且敏感性较差。葡萄球菌蛋白A(staphylococcal protein A，SPA)具有和人等多种动物IgG结合的能力，被称为“广泛二抗”，可为多种标记物所标记，已广泛用于各种免疫测定技术的间接法。用SPA代替scFv与GFP融合表达将有望得到一种新型免疫荧光检测试剂以弥补以上不足。 基于以上设想，本实验室构建了spa与egfp融合基因的原核分泌表达载体pEZZ18/egfp，并在大肠杆菌(E．coli DH5a)中成功表达，得到的融合蛋白既有荧光活性又有IgG结合活性，但原核分泌表达存在分泌效率低、胞内表达产物分离纯化步骤繁琐且信号肽不能有效切除等问题。本研究在前期工作基础上将spa-egfp融合基因转入毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)进行分泌表达，克服了上述缺点，并初步研究了表达产物SPA-EGFP作为一种新型免疫荧光检测试剂在免疫诊断方面的应用表现。 本研究通过PCR技术从质粒pEZZ18/egfp中扩增出spa-egfp融合基因，再将其克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中，成功构建了重组质粒pPIC9K/spa-egfp，并测序鉴定。重组质粒经Sal Ⅰ线性化后，电转化毕赤酵母