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慢性肾衰竭（chronic renal failure,CRF）属于中医“水肿”、“关格”、“虚劳”、“癃闭”、“溺毒”等范畴,由各种慢性肾病迁延日久发展而成,其病因病机主要责之于虚、瘀、浊、热[1]。本病初期多表现为正虚,后期逐步进展为本虚标实、虚实夹杂之证,其中虚实夹杂伴随疾病发展的整个过程,慢性肾衰竭肾功能衰竭期患者多为脾肾虚衰,湿热毒浊瘀血蓄积。清肾颗粒由大黄、黄连、白花蛇舌草、茵陈、茯苓,猪苓、白术、扁豆、泽泻、车前草、白蔻仁、薏苡仁、丹参、益母草组成,适用于慢性肾衰竭肾功能衰竭期,可以清除滞留的湿热瘀浊。现代医学研究认为,肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）作为多种慢性肾脏疾病发展至肾衰竭的共同归路,其主要的病理改变是肾间质大量细胞外基质沉积,而细胞外基质正相当于中医认识的湿热瘀浊。肾小管上皮转分化（epithetlial mesenchymal transition,EMT）后能够分泌出大量细胞外基质（extracel-lularmatrix,ECM）,对肾间质纤维化有重要的影响。前期研究发现,在UUO大鼠体内Wnt/β-catenin信号通路被激活,可能参与肾间质纤维化。本实验采用前期研究基础所得的最优血清浓度[2],进一步从细胞的角度,研究Wnt/β-catenin信号通路在肾小管上皮细胞转分化中的作用,并观察清肾颗粒对其影响:建立大鼠肾小管上皮EMT（TGF-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导）模型,采用Wnt信号通路特异性阻滞剂Dkk-1（Dickkopf-1,Dkk-1）作为对照,同时以具有清热化浊祛瘀功效的清肾颗粒进行干预。1目的探讨Wnt/β-catenin信号通路在转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用及清肾颗粒通过清热化浊祛瘀对其的影响。2方法取生长状态良好的大鼠肾小管上皮细胞株（NRK-52E）正常传代接种于12孔培养板中,待细胞生长至融合度约50%时更换无血清培养基继续同步化24h。将细胞分为5组:即空白组（正常大鼠血清）、模型组（正常大鼠血清中加入TGF-β1）、Dkk-1组（正常大鼠血清中加入TGF-β1、Dkk-1）、清肾颗粒组（清肾颗粒大鼠血清中加入TGF-β1）、清肾颗粒Dkk-1组（清肾颗粒大鼠血清中加入TGF-β1、Dkk-1）。观察各组NRK-52E细胞的形态改变;采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法来检测各组NRK-52E细胞的活力;免疫荧光法检测NRK-52E细胞E-cadherin、α-SMA的表达;Western-blot检测NRK-52E细胞E-cadherin、α-SMA、Wnt4、β-catenin蛋白表达。3结果3.1细胞形态变化正常NRK-52E细胞呈现圆形或椭圆形似铺路石样的上皮细胞的形态。在TGF-β1的诱导后,在同一视野内的NRK-52E细胞数量减少,细胞之间的空隙增宽明显,细胞的形态变长、变大。在清肾颗粒作用下,细胞向梭形及不规则形状改变的现象明显减少,细胞间隙缩小,数量增多,但与正常细胞的形态、间隙、数量仍有明显差异。3.2 MTT法测定细胞活力MTT作用24h、48h后,经TGF-β1组诱导后的NRK-52E细胞活力随时间的不断延长出现逐渐下降的趋势,在第24小时细胞活力下降50%左右,所以细胞造模选择24小时较为适宜。3.3免疫荧光法检测E-cadherin和α-SMA蛋白表达E-cadherin在空白组细胞中呈明亮红色荧光,与空白组相比,模型组荧光强度减弱。相较于模型组,Dkk-1组、清肾颗粒组、清肾颗粒Dkk-1组荧光逐渐增强,但与空白组细胞的荧光强度仍有明显差异;α-SMA在空白组细胞中几乎没有红色荧光,模型组细胞中呈明亮红色荧光。相较于模型组,Dkk-1组、清肾颗粒组、清肾颗粒Dkk-1组荧光逐渐减弱,但与空白组细胞的荧光强度仍有明显差异。3.4 Western Blot检测各组细胞中Wnt4、β-catenin、E-cadherin、α-SMA蛋白含量表达与空白组相比,模型组Wnt4、β-catenin、α-SMA蛋白表达明显上调。相较于模型组,Dkk-1组、清肾颗粒组、清肾颗粒Dkk-1组中蛋白表达逐渐减少,但与空白组比较仍有明显差异;E-cadherin在空白组中出现明显的蛋白表达且在各组中最强,模型组中蛋白表达较少。相较于模型组,Dkk-1组、清肾颗粒组、清肾颗粒Dkk-1组中蛋白表达逐渐增多,但与空白组比较仍有明显差异。4结论（1）在TGF-β1诱导的NRK-52E细胞转分化过程中,Wnt/β-catenin信号通道被激活,Wnt/β-catenin信号通道的激活可能参与了NRK-52E细胞的EMT进程;（2）清热化浊祛瘀法可抑制活化的Wnt/β-catenin信号通路,使TGF-β1诱导的NRK52E细胞中α-SMA的表达减少,E-cadherin的表达增多;（3）清热化浊祛瘀法能够延缓TGF-β1诱导的NRK-52E细胞EMT进程。