牛大力功能成分的分离纯化、结构鉴定及活性研究

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牛大力(Millettia Speciosa Champ.)是我国药用历史悠久的中药材,具有很高的营养价值与经济价值。目前国内外对牛大力的研究很少,而且并不深入。本文对牛大力水提部分与醇提部分进行了比较综合、全面的研究。水提部分重点对牛大力糖蛋白进行了分离纯化和结构鉴定,并初步探讨了乙醇提取部分小分子化合物的抗氧化活性。得到以下结论:牛大力块根中含有水分5.92%,粗蛋白7.54%,粗纤维47.62%,,粗脂肪0%,灰分2.33%,总糖28.70%。通过单因素实验和正交试验,以牛大力糖蛋白得率为考察指标,优化牛大力糖蛋白的提取工艺,得到最优工艺参数为:超声时间30 min,液料比20:1,超声功率800 W,提取温度55℃,此时糖蛋白得率为2.51%。牛大力粗糖蛋白MSCG经超滤、Sephadex G-75凝胶柱层析和ODS反相色谱柱层析后得到两个纯化糖蛋白MSCG-1和MSCG-2。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和高效液相色谱分析都表明MSCG-1和MSCG-2是较纯的糖蛋白,MSCG-1的分子量为62.0 k Da,MSCG-2为1.94 k Da。氧自由基清除能力(ORAC)结果表明,MSCG-1的ORAC值为56.10±18.49μmol Trolox/g,MSCG-2为1077.19±60.82μmol Trolox/g。一系列理化性质分析结果表明,MSCG-1中蛋白含量为50.22%,主要由天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸等构成;总糖含量为38.07%,含有鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩尔比为1.27:25.55:1.16:1:4.12:7.42:21.60;糖链由1→4,6连接的半乳糖构成主要骨架,大量阿拉伯糖分布在支链中,并含有一定比例的→6)-Manp-(1→和→6)-Glcp-(1→,存在β-型糖苷键。MSCG-2中蛋白含量为69.37%,主要由脯氨酸和半胱氨酸构成;总糖含量为6.70%,含有鼠李糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖,摩尔比为1.84:5.35:1.17:1:3.13:48.62:3.00;糖链很有可能是由1→6连接的葡萄糖构成主链,分支度高,且含有一定的Araf、Manp与Galp结构单元,同时存在α-型和β-型糖苷键。MSCG-1和MSCG-2中都含有O-糖肽键。乙醇提取牛大力小分子化合物,并用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取,得到MPEL、MEAL和MBL三个组分。MPEL中皂苷、总酚、黄酮含量分别为415.8、34.0、32.6 mg/g;MEAL中分别为468.2、118.6、87.3 mg/g;MBL中分别为294.2、51.0、8.5 mg/g。对各有机相进行了抗氧化活性评价,在各项指标中MEAL均为最优。其ORAC值为3920.81±88.86μmol Trolox/g;ABTS·+清除能力为1285.14±22.11μmol Trolox/g;DPPH·清除能力在浓度为0.75 mg/m L时达到93.24±0.27%;还原力在浓度为1.25 mg/m L时达到1.28。最后采用固相萃取C18-SPE小柱对各相进行初步分离纯化,HPLC分析结果表明纯化效果较好。
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