阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的两大重要的病理学特征是神经细胞内的大量神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)和神经细胞间的大量老年斑(senile plaques,SP),临床表现为进行性记忆减退。神经原纤维缠结主要由异常过度磷酸化的骨架蛋白tau构成,而老年斑的核心成分是由β-淀粉样前体蛋白(β-amyloid precursor protein,APP)降解产生的β-淀粉样多肽(β-amyloid, Aβ)。目前AD的发病机制仍不清楚,解释其发病机制的主要学说有“tau异常学说”和“Aβ毒性学说”,但孤立地用一种学说不能全面地解释AD脑中的病理改变。虽然存在很多发病过程,但其确切的影响因素和发病机制至今仍未完全明了。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是甲基化循环的一个中间产物,它在细胞蛋白质、DNA和脂类的甲基化中起重要作用。流行病学调查和临床研究发现,AD的发生与血浆的Hcy关系密切,高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia,HHcy)是AD强而独立的危险因子。我们在本研究中,利用大鼠经尾静脉注射Hcy14天,或辅饲叶酸和维生素B12进行治疗,来探讨HHcy是否引起大鼠出现AD样改变及其可能的机制。第一部分同型半胱氨酸诱导大鼠海马tau蛋白过度磷酸化及其机制研究在本实验中,我们利用青年健康的雄性SD大鼠,经尾静脉注射Hcy复制HHcy模型,来研究大鼠是否出现AD样tau蛋白磷酸化并探讨其机制。具体的方法和结果如下:一、Hcy升高对大鼠海马tau蛋白磷酸化的影响为了研究Hcy对tau蛋白磷酸的影响,大鼠尾静脉注射Hcy 400μg/kg/day 3、7、14、21天,结果显示:tau蛋白在Ser396和Ser199/Ser202位点出现过度磷酸化,并且磷酸化的程度随着时间的延长而加重。然后我们用两个不同的Hcy剂量(400μg /kg/day或1600μg /kg/day)对大鼠注射14天,或同时辅以叶酸和维生素B12作治疗组,用相关抗体进行Western-blotting检测,结果发现tau蛋白出现多位点的磷酸化;免疫组化和银染的结果与上述一致,叶酸和B12能减轻Hcy的此种效应。Hcy的剂量升高到1600μg/kg/day时,除Thr205和Ser214两个位点外,其余位点的磷酸化没有进一步增加。因此,我们就选择Hcy 400μg/kg/day的量注射大鼠14天,作为机制探讨的模型,来进行更进一步的研究。二、HPLC测定的血液中Hcy浓度为了证实大鼠tau蛋白出现的过度磷酸化是Hcy浓度升高所致,我们采用高压液相色谱检测大鼠血浆中的Hcy的浓度。经过14天的Hcy注射,血浆中的Hcy浓度显著的升高,当增补叶酸和B12后明显的降低Hcy的浓度。这些结果表明提高血液中的Hcy能诱导大鼠出现AD样多位点的磷酸化。三、血浆中Hcy的升高对PP-2A和GSK-3活性的影响及与活性相关的修饰我们用32P-ATP检测了PP-2A的活性,发现注射Hcy后,海马神经元PP-2A的活性降低40%。Western-blotting检测发现PP-2Ac总的表达水平没有变化,PP-2Ac的Leu309的甲基化(活性形式)水平显著降低,而Leu309去甲基化水平(失活形式)显著提高。我们又检测了PP-2Ac的磷酸化,发现PP-2Ac Tyr307位点的磷酸化显著增加,与PP-2Ac Leu309位点的去甲基呈正相关。当增补叶酸和B12时,PP-2A的活性可以恢复至对照组的85%,并增加Leu309位点的甲基化和降低Tyr307位点磷酸化。这些说明Hcy通过阻断PP-2Ac的甲基化和增加PP-2Ac的磷酸化来抑制PP-2A的活性。GSK-3是AD中一个关键的激酶,我们利用32P-ATP检测它的活性,发现各组间没有显著性差异;Western-blotting显示,GSK-3总的表达水平和Ser-9位点的磷酸化水平无明显变化。这就可以排除GSK-3参与了Hcy诱导大鼠tau蛋白的过度磷酸化。我们又检测了调节PP-2Ac甲基化的两个酶:甲酯酶(PME)和S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶(PPMT)表达情况。结果发现PPMT的表达水平各组间无差异,但在Hcy组PME的表达水平显著增加,这就表明Hcy注射引起PP-2Ac的去甲基化是由PME导致的,增补叶酸和维生素B12可以部分恢复Hcy导致的PME的升高。四、PP-2Ac去甲基化对PP-2A生物学功能的影响为了探讨Hcy诱导的PP-2Ac去甲基化对PP-2Ac生物学功能的影响,我们用总PP-2A抗体进行免疫沉淀,用Western-blotting检测发现,PP-2Ac的总量各组间无变化,但Hcy组的去甲基化水平和磷酸化水平比对照组显著增加,且沉淀物中PP-2AB显著减少,说明PP-2Ac的去甲基化降低了PP-2Ac结合调节B亚基的能力。接着用去甲基化的PP-2Ac抗体免疫沉淀,发现沉淀中去甲基化的PP-2Ac同时被磷酸化,PP-2Ac的去甲基化和磷酸化间有高度的正相关;增补叶酸和维生素B12可以减轻Hcy引起的这些变化。这些结果表明PP-2Ac的去甲基化可以促进它的磷酸化,并共同抑制PP-2A的活性。五、甲基化修饰的PP-2Ac和磷酸化tau蛋白在Hcy诱导的大鼠海马和AD脑中的相互关系和分布为了探讨去甲基化的PP-2Ac和磷酸化的tau蛋白共定位关系,我们用甲基化的PP-2Ac、去甲基化的PP-2Ac和PS396抗体进行免疫荧光双标。结果发现Hcy组大鼠海马CA1区磷酸化显色明显加强,同时去甲基化PP-2Ac的免疫活性也相应增加;但是甲基化PP-2Ac的显色显著减弱。同时还发现只有去甲基化的PP-2Ac与磷酸化的tau蛋白共定位,而甲基化的PP-2Ac与磷酸化的tau蛋白完全不共定位。上述这种定位关系在AD病人脑海马中也同样显著。这些结果强烈说明了在Hcy诱导的大鼠脑和AD病人脑中,PP-2Ac的去甲基化导致了tau蛋白的磷酸化。结论在本实验中,我们发现提高血液中的Hcy能通过失活PP-2A来导致tau的磷酸化。致使PP-2A失活的机制主要是PP-2Ac的去甲基化,并由此导致PP-2Ac的磷酸化和PP-2Ac结合PP-2AB亚基的能力降低。PME表达增加可能是Hcy升高时引起PP-2Ac去甲基化机制。同时增补叶酸和维生素B12可以部分的恢复血浆Hcy的水平,并减轻PP-2Ac的异常修饰和降低tau蛋白的磷酸化。第二部分同型半胱氨酸诱导大鼠空间记忆障碍和Aβ增多并聚集的机制我们在本实验中,用同型半胱氨酸进行大鼠尾静脉注射14天,复制高同型半胱氨酸血症模型,来探讨Hcy引起大鼠空间记忆障碍和Aβ产生增加的机制。实验方法和结果如下:一、Hcy升高对大鼠海马APP代谢的影响为了研究Hcy升高对大鼠海马内APP的代谢影响,我们采用尾静脉注射Hcy 400μg/kg/day,分为3、7、14、21天。结果显示:4G8和6E10的显色加深,说明APP在β-位点的切割增加,并随着时间的延长而增加。因为14天的Hcy注射能显著的诱导APP蛋白分解代谢变化,然后我们用两个不同的Hcy剂量(400μg /kg/day或1600μg /kg/day)注射大鼠14天,或同时辅以叶酸和维生素B12治疗,结果发现两个剂量都能导致APP在β-位点的切割增加,叶酸和维生素B12对上述有拮抗作用。当Hcy的剂量升高到1600μg/kg/day时,Aβ的产生没有进一步增加。因此,我们就选择Hcy 400μg/kg/day的量注射大鼠14天,作为机制探讨的模型,我们利用大鼠脑切片,用Aβ的抗体免疫组化和用Thioflavin-S染色,结果进一步证明,Hcy升高可以导致大鼠皮质和海马Aβ的产生增加,并且叶酸和B12能减轻Hcy的此种作用。说明了Hcy导致AD样毒性部分是通过Aβ的产生增加而致。二、Hcy对大鼠空间记忆的影响为了证明Hcy引起了大鼠行为学的损伤,我们采用Morris水迷宫的方法检测大鼠的空间记忆情况。结果发现HHcy可以明显的损伤大鼠的空间记忆能力,其中以低剂量的Hcy结果最明显。叶酸和维生素B12可以拮抗Hcy的作用,提高大鼠的记忆能力。三、ELISA测定大鼠皮质和海马Aβ40的含量用ELISA的方法测定大鼠皮质和海马Aβ40的实际含量。两个不同剂量的Hcy注射14天后,大鼠皮质和海马Aβ产生的量显著升高,以低剂量的Hcy最明显,并且皮质的变化最显著,当辅饲叶酸和维生素B12后,能明显的降低Aβ的产生。四、RT-PCR检测APP及其代谢分泌酶基因水平的变化用相应引物进行RT-PCR反应。结果发现除γ-分泌酶的PS1基因在mRNA水平表达升高外,其余酶和蛋白在RNA水平均无显著性变化。当加饲叶酸和维生素B12后,能显著降低γ-分泌酶PS1在RNA水平上的变化。这说明Aβ增加不是因为APP表达水平的改变引起,而是受其代谢变化或其它变化影响所致。五、翻译后蛋白水平的检测因为APP和α-、β-分泌酶在基因水平上没有改变,接着我们用Western-blotting来检测β-和γ-分泌酶PS2的表达,结果发现它们在翻译水平上也无明显的改变。因为用4G8和6E10两抗体检测,β切割产生的片段呈强阳性反应,且Aβ的产生量显著增加,我们就用p-Thr668-APP抗体(识别磷酸化的APP Thr668位点)检测APP磷酸化的修饰情况,发现APP在Thr668位点的磷酸化加强,与对照组相比有显著的差异性,叶酸和维生素B12能显著降低这种变化。免疫组化结果与Western-blotting结果一致。说明Hcy导致APP出现了异常磷酸化修饰.六、磷酸化APP对自身代谢的影响为了进一步探讨磷酸化修饰的APP对自身代谢的影响,我们又用磷酸化p-Thr668-APP的抗体去免疫沉淀,结果发现磷酸化的APP阳性显色增加,还可以见切割的磷酸化APP片段;并且沉淀中BACE1和PS2数量显著升高;叶酸和维生素B12对上述Hcy的影响有拮抗作用。这说明APP磷酸化修饰后,增加了与β-和γ-分泌酶的亲和力,使APP便于β、γ-分泌酶切割,因此导致了Aβ的产生增加。结论总之在本实验中, HHcy一方面通过增加PS1的表达,提高γ-分泌酶的活性,另一方面通过增加APP Thr668的磷酸化修饰,增加APP与分泌酶的亲和性,致使Aβ产生增多。增补叶酸和维生素B12可以部分的恢复血浆Hcy的水平的同时,并减轻PS1的表达和APP的异常修饰,降低Aβ的产生和聚集。