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第一部分体外IFN-γ对NSCs活性、增殖、分化及氧化应激水平的研究目的本部分实验旨在通过从体外水平来研究IFN-γ对NSCs活性、增殖、分化及氧化应激水平的影响,并与其他四种细胞因子BDNF、VEGF、TGF-β1及IGF-1进行比较。方法提取胎鼠原代NSCs,通过细胞形态及免疫荧光鉴定细胞特异性标志物;用不同浓度IFN-γ对NSCs进行干预,通过细胞形态及CCK8评估其是否对NSCs有毒性,并用其他四种细胞因子BDNF、VEGF、TGF-β1及IGF-1进行对比评价细胞的增殖及分化情况;另通过WB及qPCR等检测IFN-γ对NSCs的状态、信号通路及氧化应激水平的影响。结果原代NSCs体外培养呈神经球样,表达特异性标志物Nestin,成功分化为神经元、星形胶质及少突胶质细胞。不同浓度IFN-γ对NSCs无毒副作用,在20ng/ml浓度时轻度促进细胞增殖,但与其他四种细胞因子无明显差异;在分化条件下,IFN-γ促进NSCs分化为神经元(Tuj1)的比例明显增多,能力优于其他四种细胞因子。此外IFN-γ在干预早期活化NSCs,激活下游Jak1/Stat1通路,及增加细胞内的氧化应激表达。结论成功提取培养了胎鼠海马区原代NSCs,IFN-γ对NSCs无明显毒副作用,在分化条件下IFN-γ能促进NSCs更多地分化为神经元;且IFN-γ在早期影响NSCs状态,增加细胞的抗氧化应激能力,及活化下游Jak1/Stat1信号通路。第二部分联合IFN-γ和NSCs体内移植治疗脑缺血大鼠的作用研究目的本部分实验旨在从体内水平通过联合IFN-γ与NSCs移植治疗缺血性脑卒中大鼠,探讨IFN-γ在NSCs移植治疗过程中的潜在作用。方法构建大鼠脑缺血MCAO模型,将不同浓度IFN-γ(50ng或500ng)单独或联合NSCs定向移植,通过m NSS和Rotarod评分来评估MCAO大鼠的神经功能改善情况,TTC染色计算治疗28天后的脑梗塞体积,尼式和TUNEL染色评估大鼠脑缺血区神经细胞的变性及坏死程度,双标免疫荧光染色(Brdu+DCX/GFAP)检测脑缺血区移植NSCs分化为神经元和星形胶质细胞的情况,免疫组化评估MCAO大鼠脑缺血周围小胶质细胞(Iba1)及T细胞(CD4+和CD8+)的表达,ELISA检测脑脊液中4种促炎因子(IL1β、IL6、TNF-α和IFN-γ)和两种抗炎因子(IL-10和TGF-β1)的表达,及WB评估治疗后IFN-γ下游信号通路及体内氧化应激SOD2的表达。结果低浓度IFN-γ(50ng)协同增加了NSCs移植对MCAO大鼠的治疗作用,联合治疗后14天和28天的神经功能改善程度优于单独NSCs组,并进一步减少了脑梗塞体积;IFN-γ的协同治疗还保护了脑缺血区神经细胞的存活,增加了移植NSCs分化为神经元的比例。而高浓度IFN-γ(500ng)在体内却增加了炎症反应程度(如小胶质细胞和T细胞活性),但对NSCs的治疗作用没有影响,NSCs共同移植后一定程度上减少了高浓度IFN-γ的炎症影响,降低了大鼠体内的炎症水平。IFN-γ下游Stat1信号通路被激活。结论单纯IFN-γ的体内移植对脑缺血大鼠神经功能改善无效,低浓度IFN-γ(50ng)与NSCs联合可协同促进脑缺血大鼠的神经功能恢复、减少神经细胞的凋亡与坏死,且促进移植NSCs更多地分化为神经元;而高浓度IFN-γ(500ng)在体内增加了神经炎症反应,NSCs的共同移植可以在一定程度上中和或减轻高浓度IFN-γ对其神经炎症影响。第三部分IFN-γ刺激前后NSCs来源外泌体在体外及体内中的作用研究目的因成功获得人源human NSCs(hNSCs),后续实验在此细胞基础上进行。本部分实验旨在通过提取人源hNSCs培养上清中的外泌体,探索IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体在体内外的潜在功能,并进行相关功能对比研究。方法从孕3月左右胎儿脑海马中提取原代hNSCs,通过细胞形态及免疫荧光等鉴定hNSCs基本特征。通过超高速离心及外泌体提取试剂盒提取hNSCs培养上清中的外泌体,进行了相关鉴定。通过过氧化氢H2O2构建细胞应激模型,利用IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体进行干预,通过CCK8、活死细胞及免疫荧光染色等评价细胞活性及坏死凋亡情况;PKH67标记外泌体后评价其在体内外的迁移;并用外泌体定向移植治疗MCAO大鼠后评价大鼠的神经功能、脑梗塞面积、神经细胞增殖及神经血管重建等情况。结果原代hNSCs体外培养呈典型神经球样,明显表达特异性标志物Nestin、SOX2及Musashi1,并成功分化为三系;hNSCs来源外泌体具有外泌体典型大小及形态特征,明显表达特异性标志物Hsp70、CD63和Tsg101。体外实验示外泌体明显增加了H2O2应激模型下细胞的活力减少了细胞凋亡坏死,另外泌体还可影响hNSCs的分化方向。体内实验示外泌体可有效治疗MCAO大鼠,促进大鼠神经功能恢复、减少脑梗塞面积、保护缺血区神经细胞存活、增加神经细胞及微血管发生等,且以IFN-γ刺激后产生的外泌体效果尤甚。PKH67标记的外泌体在体外及体内均可顺利迁移至细胞内及进行远处迁移。结论成功提取了人源hNSCs及其培养上清中的外泌体;在体外水平发现外泌体可以在一定程度上缓解了H2O2模型下细胞的凋亡坏死并增加细胞的增殖活力;在体内水平则证实外泌体的定向移植可以有效改善脑缺血大鼠的神经功能、减少脑梗塞面积并促进了脑缺血区神经微血管重建,且以IFN-γ刺激后产生的外泌体疗效更加显著。第四部分NGS检测IFN-γ刺激前后NSCs外泌体中miRNA表达调控研究目的本部分实验旨在通过高通量测序检测IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体中miRNA的表达差异,并验证及研究其中潜在功能miRNA,探讨外泌体的潜在调控机制。方法通过超高速离心获取IFN-γ刺激前后hNSCs分泌的外泌体,提取相关RNA后进行高通量测序;统计其中存在差异表达的miRNAs,进行靶基因预测及GO、KEGG分析。qPCR验证其中差异显著的miRNA,挑选3个miRNAs进行功能评价;通过转染miRNA minics进入hNSCs内后用H2O2应激模型评估细胞凋亡坏死,并利用外泌体转染特异性miRNA评价其对hNSCs的转导效应。结果对IFN-γ刺激前后hNSCs分泌外泌体中的RNA进行高通量测序及分析(如总Reads数及nc RNA注释等),通过数据库对miRNAs数量进行统计及表达量校正,发现了47个差异表达miRNAs(24个上调和23个下调);经调整差异倍数及P值(|log2(Fold Change)|≥2,且P<0.01),对差异最显著的7个miRNAs进行了qPCR验证(hsa-miR-206、hsa-miR-133a-3p、hsa-miR-3151-5p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-3656、hsa-miR-34c-3p和hsa-miR-4677-5p);另发现外泌体可将特异性Cel-miR-39-3p转导入hNSCs内成功表达,且转染了hsa-miR-133a-3p和hsa-miR-3656的hNSCs在H2O2应激模型下细胞凋亡比例下降。结论通过高通量测序分析了IFN-γ刺激前后hNSCs分泌外泌体中的miRNA表达,筛选出差异性表达miRNA后并用qPCR鉴定了其中差异最显著的7个miRNAs;证实了外泌体主要通过传导功能性miRNA进入细胞内发挥潜在生物学作用;其中IFN-γ刺激hNSCs后产生的外泌体可能主要是通过传导hsa-miR-133a-3p和hsa-miR-3656增加细胞应激能力来减少H2O2模型下细胞的凋亡坏死。