【摘 要】
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研究目的:流感是由流感病毒感染所致的流行性传染病,季节性流感每年都会引起大规模的世界范围内的传播,对经济以及卫生领域造成很大的危害。每年世界卫生组织都要不断监测流感病毒流行的毒株和传播模式,以应对下一次流感的大流行。应对流感病毒的感染和传播,接种预防性疫苗是一种重要的防治策略,但是流感疫苗的毒株多样性和变异高频性给疫苗研发带来重大挑战,此外,流感病毒的耐药性也极大阻碍了流感病毒感染的防治。近年来,
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研究目的:流感是由流感病毒感染所致的流行性传染病,季节性流感每年都会引起大规模的世界范围内的传播,对经济以及卫生领域造成很大的危害。每年世界卫生组织都要不断监测流感病毒流行的毒株和传播模式,以应对下一次流感的大流行。应对流感病毒的感染和传播,接种预防性疫苗是一种重要的防治策略,但是流感疫苗的毒株多样性和变异高频性给疫苗研发带来重大挑战,此外,流感病毒的耐药性也极大阻碍了流感病毒感染的防治。近年来,治疗性流感单克隆抗体是应对流感病毒感染的一种新策略,其中通用广谱流感单克隆抗体更是治疗流感感染的重要研究方向。目前注射流感疫苗产生的抗体大多是针对流感血凝素头部,并且流感血凝素作为流感病毒表面包膜的主要糖蛋白是流感病毒侵入机体的主要介质,流感血凝素的茎部区域也是抗体识别的主要位点。单克隆抗体CR9114已被证实可以识别多种不同亚型的流感病毒,且具有一定的中和作用。但是该抗体主要针对的流感病毒株为H1N1,对其他型别病毒株的中和作用相对较弱。本研究将首先探索野生型CR9114抗体的基本特征,进一步突变流感抗体CR9114CDR区氨基酸位点,分析CR9114抗体的结合力、亲和特征、识别表位信息及体外中和活性进行分析,以确认这些氨基酸位点的改变对抗体基本特性的影响。该研究为后续的高致病性流感病毒的治疗抗体药物筛选和评价提供新的思路。方法:首先,对野生型(H+L)CR9114抗体及不同突变型流感单克隆抗体,包括重链单突变抗体(H-A+L)、轻链单突变抗体(H+L-A)、重链轻链双突变抗体(H-A+L-A)进行表达和纯化。第二步,获取流感病毒毒株的RNA经过逆转录得到cDNA,并利用特异性引物PCR扩增获得不同流感毒株的抗原目的片段:H1N1-HA1、H1N1-HA2、H7N9-HA1、H7N9-HA2。并构建 pmCherry-H1N1-HA1、pmCherry-H1N1-HA2、pmCherry-H7N9-HA1、pmCherry-H7N9-HA2,流感病毒的抗原表达载体。第三步,利用酶联免疫吸附实验、能量共振转移、免疫共沉淀、微量中和实验等,验证野生型及突变型抗体与不同流感病毒抗原的亲和力和中和活性。结果:突变型及野生型流感抗体均可以识别流感病毒株抗原包括H1N1-HA、H5N1-HA、H7N9-HA,并可以中和H1N1和H7N9毒株。研究结果提示我们,氨基酸位点改变对流感抗体表达、亲和力、及中和效果等均具有一定的影响。其中,轻链或重链单个氨基酸位点的突变能够对CR9114抗体亲和力产生一定的作用,轻重链双突变抗体亲和力明显下降。中和实验结果表明,轻链单突变抗体与其余两种突变体相比,体外中和效果相对较好。综上,对CR9114进行轻链单突变改造可以一定程度增强抗体的广谱性和中和效果。
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