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近年来,关于天然免疫识别学说--模式识别理论的提出推动了免疫学的发展。模式识别受体-病原体相关分子模式(pattern recognition receptor-pathogen associated molecule pattern, PRR-PAMP)的研究引起高度关注。甘露聚糖结合凝集素(mannose-binding lectin, MBL)是重要的PRR之一,在固有免疫中扮演重要角色。当MBL识别病原体时,其下游的蛋白酶MASP-2(mannose-binding lectin associated serine protease-2)通过裂解丝氨酸蛋白酶域N端的精氨酸-异亮氨酸间的肽键发生自激活作用,在补体激活的凝集素途径中发挥重要作用。另有研究表明,MASP-2与肿瘤,感染性疾病和自身免疫性疾病有关。因此,对MASP-2的研究已成为研究天然免疫的热点之一。MASP-2由6个功能区组成,其中EGF功能区含Ca2+结合模体,SP功能区具有较高的激活凝血酶能力,参与MASP-2的自激活。本课题拟在构建构建MASP-2EGF和SP原核表达载体重组质粒的基础上,在异丙基硫代半乳糖苷的作用下进一步诱导表达蛋白,纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体,以期为为后续检测体液MASP-2含量、分析不同细胞MASP-2表达情况奠定基础。首先从胎肝提取总RNA,反转录合成cDNA后以此为模板,应用PCR技术扩增得到特异性EGF、SP基因,采用酚-氯仿抽提法提纯PCR产物,对EGF、SP片段和pGEX-6p-2质粒进行BamH I、Not I双酶切,凝胶回收各片段,以T4DNA连接酶分别连接EGF和SP片段酶切产物与pGEX-6P-2载体构建重组质粒。采用热休克法分别将EGF、SP重组质粒转化导入E.coli BL21感受态细菌,转化后菌液直接涂布于LB固体选择培养基培养过夜。采用针对pGEX-6p-2质粒通用引物的菌落PCR初筛LB平板上生长的单克隆菌落,将阳性扩增的单克隆接种于LB液体选择培养液震荡培养过夜,提取质粒为模板,以载体通用引物分别和EGF、SP目的片段的特异引物进行cross-PCR鉴定,并同时进行BamH I、Not I双酶切鉴定。Cross-PCR扩增阳性和双酶切鉴定均正确的质粒进行DNA序列测定鉴定重组质粒正确性。序列测定结果与GenBank公布的masp-2EGF和SP标准序列比对完全一致,且没有发现移码现象,说明成功构建pGEX-6P-2-EGF、pGEX-6P-2-SP原核表达重组体。确定重组表达载体成功构建后,转化pGEX-6P-2-EGF和pGEX-6P-2-SP重组载体于E.coli BL21感受态细菌,将菌液涂布于LB固体培养基培养过夜后挑取单个菌落,接种于LB液体培养基培养过夜；次日扩大培养一定时间力(?)IPTG诱导表达,低温离心并洗涤菌体沉淀后,再次低温离心弃上清收集菌体；超声裂解所获菌体,分别收集上清和沉淀,制样进行SDS-PAGE分析,考马斯亮蓝染色后分析蛋白表达形式,GST-EGF融合蛋白在上清表达,为可溶性蛋白；而SP融合蛋白只以包涵体形式存在,经尿素处理后,纯化GST-EGF和GST-SP融合蛋白。最后分别用纯化的GST-EGF和GST-SP融合蛋白免疫6-7周龄BALB/c小鼠,免疫完成后取小鼠血清分别检测其抗体特异性和效价。大量诱导GST-EGF和GST-SP融合蛋白,分别于第0、21、35天对小鼠进行三次腹腔注射免疫,并设置对照组,末次免疫7天后取血,分离并保存血清,Western blotting检测血清EGF、SP抗体特异性,间接酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清中EGF、SP抗体水平；EGF鼠抗血清效价达1：32000,SP鼠抗血清效价达1：40000,WB结果显示融合蛋白组小鼠血清稀释1000倍后仍有特异性目的条带出现,对照组不出现,本实验制得高特异性和高效价SP和EGF抗体。