目的建立大鼠原代肝细胞提取鉴定体系,比较对乙酰氨基酚作用于2D培养的大鼠原代肝细胞、3D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的毒性特点。方法采用胶原酶原位两步灌流法提取大鼠原代肝细胞,并通过PAS糖原染色和肝细胞双核结构进行鉴定;以光学显微镜和扫描电子显微镜来观察3D培养的大鼠原代肝细胞在cellusponge海绵支架上的生长情况。应用CCK8法对2D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的生长规律进行研究;以肝毒性药物对乙酰氨基酚(APAP)为阳性药,用CCK8法测定2D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A细胞的IC50,并对其毒性作用规律进行研究;通过光学显微镜、HE染色和透射电镜来观察药物对两种细胞的损伤情况。以全自动生化分析仪来检测药物作用三种细胞模型之后细胞上清AST、ALT、LDH、ALP、ALB、BUN、TP、GLU生化指标的变化。结果每只SD大鼠可获得(100-300)×106个细胞,细胞活率浮动在80%-95%,PAS糖原染色显示阳性,光学显微镜下观察大量细胞为双核结构,鉴定为大鼠原代肝细胞。2D培养的大鼠原代肝细胞最佳接种密度为60000个/cm2,最佳液面深度为1.5mm,接种4h之后开始贴壁,接种24小时大部分贴壁,48h完全贴壁,可见细胞连成岛状结构,接种第一天细胞数量略有下降,在第3-5天进入对数生长期,第7天开始进入衰退期;大鼠原代肝细胞在以cellusponge为支架的三维培养系统中培养时,在培养24h之后即有部分细胞聚集成团,培养三天之后大部分细胞形成团,培养5天之后细胞形成直径约70mm的细胞团,培养第7天细胞形成直径大约100mm-150mm的细胞团。BRL-3A细胞根据接种密度的不同,潜伏期和对数期持续长短各不相同,最佳的接种密度在(1-2)×104个/m L,接种48h后进入对数生长期,持续约3天。APAP作用于大鼠原代肝细胞24h的IC50为18.03mmol/L,95%CI=(17.28,18.81)mmol/L,作用于BRL-3A的IC50为20.05mmol/L,95%CI=(18.99,21.17)mmol/L,APAP对2D培养的大鼠原代肝细胞和BRL-3A的毒性作用随着作用时间延长而增大,相同时间内,毒性作用呈现剂量依赖性。对BRL-3A的HE染色结果显示低浓度组细胞胞核圆形、卵圆形或不规则形,胞浆宽窄均一,核浆比例均匀,可见分裂核;高浓度组细胞散在,可见弥漫分布,细胞明显淡染,结构不清,细胞核几乎不可见。透射电镜结果显示,30mmol/L的APAP对2D培养的原代大鼠肝细胞和BRL-3A细胞造成细胞器肿胀,核膜破裂,细胞膜边界模糊不清;随着药物剂量的增加,与对照组相比,大鼠原代肝细胞10、25、30 mmol/L组的AST和所有给药组的GLU显著升高(P<0.01),但BRL-3A细胞各剂量组的GLU、AST并未发生显著改变。3D培养的大鼠原代肝细胞暴露于5m M、20m M、30m M的低中高浓度APAP作用下,随着药物浓度增大,其ALB、BUN含量显著降低,AST、GLU、AST显著升高,低、中浓度组的LDH显著升高,低浓度组的ALP和TP显著升高。结论永生化细胞BRL-3A和2D、3D培养的大鼠原代肝细胞暴露于肝毒性药物对乙酰氨基酚时,与BRL-3A相比,二维培养的大鼠原代肝细胞酶学指标变化较为丰富,但其体外培养存活时间较短;BRL-3A细胞缺少肝脏重要酶类,增加永生化细胞BRL-3A肝脏酶类是提升BRL-3A细胞作为肝脏毒性筛选模型的更好手段之一;原代大鼠肝细胞三维培养模型的酶学指标变化最丰富,与在体肝脏功能最为接近,是三种模型中较为理想的肝毒性评价模型。