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背景和目的我国结直肠癌(CRC)发病率较高,是导致癌症死亡的主要原因之一,严重威胁居民的身体健康。多数患者就诊时处于中晚期,而CRC的预后取决于病理分期。因此,探索结直肠癌的致癌机制、寻找新的治疗方法来诊治结直肠癌就显得尤为重要。长链非编码RNA(lncRNAs)是一种RNA分子,它有长于200个核苷酸,不能被翻译成蛋白质。lncRNAs参与到细胞生理学的各个方面,对癌症的形成、进展和转移至关重要。lncRNA GAS5,位于1号染色体长臂25区,具有肿瘤抑制基因的功能,多项研究表明GAS5在多种癌症中表达是下调的,包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌等,并且在肿瘤细胞増殖和调亡等过程中发挥重要作用。据报道miRNA参与癌症形成中的多个环节,并可发挥致癌或抑癌功能。研究表明lncRNA-miRNA的相互作用可调节基因的表达。lncRNA可作为内源性“海绵”来吸附miRNA,从而调节基因表达。而miR-182-5p的异常表达在包括结肠癌癌在内的各种恶性肿瘤中起着致癌作用。因此,我们猜测GAS5同样可以作用于miR-182-5p,而关于GAS5与miR-182-5p之间关系及对结直肠癌增值和凋亡的研究较少,因此,本课题从GAS5与miR-182-5p着手去研究其对结直肠癌细胞增值和凋亡的作用。方法第一部分:RT-PCR检测60例结直肠癌组织及正常组织中GAS5表达情况;RT-PCR检测HCT-116细胞、HT-29细胞、SW480细胞、LoVo细胞和正常结肠上皮细胞系NCM460中GAS5表达情况;构建GAS5过表达载体分别转染HT-29和SW480细胞,用RT-PCR检测GAS5表达情况;分析GAS5 mRNA表达水平和临床病理特征的关系。第二部分:构建GAS5过表达载体分别转染HT-29和SW480细胞24h、48h和72h后,用细胞计数CCK-8法分析细胞增殖能力;构建GAS5过表达载体分别转染HT-29和SW480细胞48h后,用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞凋亡率。第三部分:使用生物信息学在线软件程序(DIANA工具)去预测与GAS5相互作用的潜在miRNAs;RT-PCR检测80例结直肠癌组织中GAS5和miR-182-5p水平,并进行相关性分析;用双荧光素酶报告实验验证miR-182-5p与lnc RNA GAS5之间的靶向关系;构建HT-29细胞过表达GAS5后,用RT-PCR检测GAS5和miR-182-5p表达情况;构建SW480细胞沉默GAS5后,用RT-PCR检测GAS5和miR-182-5p表达情况。第四部分:miR-182-5p模拟物转染HT-29细胞株后,分别用CCK-8法和Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞的增殖、凋亡情况;用GAS5过表达载体、GAS5过表达载体联合miR-182-5p模拟物分别转染HT-29细胞株后,用CCK-8法和Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒检测细胞的增殖、凋亡情况;构建HT-29细胞过表达GAS5、SW480细胞沉默GAS5模型后,使用RT-PCR和Western Blot检测FOX3a表达情况;GAS5过表达载体、miR-182-5p模拟物、GAS5过表达载体联合miR-182-5p模拟物分别转染HT-29细胞株后,使用RT-PCR和Western Blot检测FOX3a表达情况;RT-PCR检测63例结直肠癌组织中GAS5和FOX3a水平,并进行相关性分析。结果第一部分:GAS5 mRNA在结直肠癌组织中的相对表达量明显低于正常结直肠组织,差异具有统计学意义(P<0.001);GAS5 mRNA在CRC细胞系HCT-116、HT-29、SW480和LoVo细胞中的表达低于在正常结肠上皮细胞系NCM460中的表达,且差异具有显著性(P<0.05);GAS5过表达载体转染HT-29和SW480细胞后,相比亲本细胞,可见GAS5 mRNA表达明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.001);GAS5表达与淋巴结转移和结直肠癌TNM分期相关(P<0.05),而与年龄、性别、组织学分化、浸润深度及肿瘤直径无关(P>0.05)。第二部分:CCK-8结果表明:pcDNA3.1-GAS5转染组24h、48h和72hOD值均低于pcDNA3.1-NC组OD值,其中48h OD值、72h OD值组间差异有显著统计学意义(p<0.001)。Annexin V-FITC/PI凋亡检测结果表明:pcDNA3.1-GAS5转染组细胞凋亡率数值高于pcDNA3.1-NC组的数值(p<0.001)。因此,GAS5的过表达抑制了CRC细胞增殖,促进了CRC细胞的凋亡。第三部分:发现miR-182-5p中包含了一个与GAS5互补的核苷酸序列;80例CRC组织中GAS5基因和miR-182-5p基因的表达呈负相关(r=-0.42,p=0.001);双荧光素酶报告实验证实miR-182-5p可与GAS5特异性靶向结合。HT-29细胞在pc DNA3.1-GAS5转染后,Gas5基因表达明显上升而miR-182-5p基因表达明显下降。SW480细胞在si-GAS5沉默后,GAS5基因表达明显下降而miR-182-5p基因表达明显上升。第四部分:CCK-8法检测结果表明:miR-182-5p模拟物转染组各时间段的OD值均高于miR-NC组OD值,其中48h OD值、72h OD值差异有统计学意义(p<0.05);Annexin V-FITC/PI凋亡检测结果表明:miR-182-5p模拟物转染组细胞凋亡率低于miR-NC组(p<0.001)。GAS5抑制细胞增值而miR-182-5p促进细胞增值,且miR-182-5p可部分逆转GAS5对细胞的增值抑制作用;GAS5促进细胞凋亡,且miR-182-5p可部分逆转GAS5对细胞促凋亡作用。RT-PCR和Western Blot检测结果表明:GAS5过表达促进FOXO3a表达,GAS5低表达降低FOXO3a表达,miR-182-5p可减弱GAS5促进FOXO3a表达的作用;63例CRC组织中GAS5基因和FOXO3a基因的表达呈正相关(r=0.62,p<0.001)。结论GAS5在结直肠癌组织中表达低于正常组织中;在结直肠癌细胞系中表达低于正常结直肠细胞系。结直肠癌中GAS5的表达和有无淋巴结转移及TMN分期相关,提示我们GAS5可能成为结直肠癌患者预的标志物。功能实验表明GAS5过表达抑制了CRC细胞增殖,并促进了CRC细胞凋亡。机制研究表明:GAS5可与miR-182-5p特异性靶向结合,并负向调节miR-182-5p表达。GAS5过表达可通过下调miR-182-5p,抑制细胞增值和促进细胞凋亡,其机制可能是GAS5通过调控miR-182-5p来调节FOXO3a表达,从而影响CRC细胞的增殖和凋亡。