阿维链霉菌高产菌株诱变选育及其基因与蛋白差异效果研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 6次 | 上传用户:chloexg
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阿维菌素是由阿维链霉菌分泌出的一种次级代谢产物,是迄今为止发现最有效的生物杀死寄生虫的药物,是农业部推荐的一种的高效低毒的兽用药品,具有良好的应用价值和广阔的市场前景。本实验选用了阿维链霉菌作为研究对象,利用中科院近代物理研究所提供的重离子束对其进行辐照诱变,从中筛选出具有高产性能的阿维链霉菌菌株;分析重离子束对高效价诱变菌株的基因诱变效果,寻找其差异性;分析重离子束对高效价诱变菌株的蛋白诱变效果。以碳离子12C+6(100Mev/u)为辐照源,选用0Gy,10Gy,30Gy,40Gy,45Gy,50Gy,70Gy七个剂量,对效价为3900μg/ml的阿维链霉菌的孢子进行辐照。从正突变率实验结果,45Gy剂量下正突变率达到最高11.5%,因此在重离子12C+6辐照的最佳剂量在45Gy能够获得更多的效价提高的菌株。通过对诱变菌株形态的观察,发现了4菌型皱缩型、馒头型、草帽型、光秃型,其中草帽型的菌株产抗能力最强。本实验共做了621个单菌筛选并进行了发酵效价的测定,共获得效价提高菌株44株,其中147、238和HS效价最高,最高效价可达4901ug/mL。通过对碳源、氮源、无机盐、微量元素等培养基成分的优化,获得了以糊精11%、可溶性淀粉1%、酵母粉2.5%、黄豆饼粉0.5%、K2HPO4·3H2O0.06%、KCl0.1%、CoCl2·6H2O4mg/L最佳培养基配方,同时使高效价菌株HS效价提高了8%。对原始种和不同剂量下获得的高效价突变株、以及高效价菌株147、HS的DNA进行了随机扩增多态性(RAPD,Random AmplifiedPolymorphic)分析,电泳结果出现大量差异条带,经过分析结果表明12C+6离子束处理阿维链霉菌引起基因组发生改变,且同源性较高。分别对原始菌株以及高效价菌株147、HS的C、D、I、R基因设计引物、通过聚合酶链式反应,获得扩增产物,并进行测序对比分析,发现高效价突变菌株经过重离子束诱变,核酸发生碱基突变,碱基缺失,碱基置换等现象,其中I基因的部分片段缺失可能导致了147、HS效价的提高。实验对原始菌株以及高效价菌株147、HS的发酵45小时的菌液的可溶性蛋白进行提取,利用双向电泳对其蛋白进行分离。实验首先对提取条件、一向电泳程序的优化,其次选择适当的电泳胶条,最终获得分离度良好的蛋白质图谱。对AO、147、HS的可溶性蛋白的双向电泳图进行分析,AO、147、HS分别含有蛋白质点345、418、591个,且其分子量大多为24KD到67KD。147的蛋白比AO上调3倍浓度以上的有22个点,蛋白下调的有28个点;HS的蛋白比AO上调3倍浓度以上的有29个点,蛋白下调的有2倍的有19个。碳离子辐照选育的高效价阿维链霉菌在发酵初期,由于辐照诱变的效应使得核酸序列的改变,从而使得蛋白表达方面有了更多了差异,包括蛋白质点多少的差异,以及蛋白表达量的差异。AO的蛋白点最少345个,而突变高效价147与HS在发酵45小时的时候蛋白已经高效的表达,且已经超过原始菌株,这也许就是效价能够提高的原因之一。
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