恶性肿瘤的无限制侵袭性生长及其转移依赖于肿瘤血管生成(angiogenesis),特异性的抑制血管生成能显著地抑制肿瘤的生长。随着近年的研究表明:一些特异性的表达于肿瘤新生血管内皮细胞上的抗原成为抗肿瘤血管生成治疗及肿瘤早期诊断的新靶点。开发作用于这些新靶点的抗血管生成试剂,能特异性的抑制肿瘤的生长,并减少其在非瘤组织中及全身系统中毒副反应的产生。整合素αvβ3,属于粘附分子家族,它由αv和β3两个亚基组成,通过与配体的相互作用介导细胞间及细胞与基质间的粘附。它在静息状态的血管中表达极少,而在肿瘤、炎症等组织改建时表达明显增加。研究表明:整合素αvβ3的异常高表达,可以通过与多种其它细胞因子间的协同作用,如碱性成纤维细胞生长因子(basic fibro-blast growth factor,bFGF)、血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)、转化生长因子-β(transforming growth factors-β,TGF-β)等,促进了肿瘤血管形成,并且促进肿瘤的侵袭及转移。因此,特异性的干扰或破坏整合素αvβ3分子的功能,可以抑制表达αvβ3分子的肿瘤新生血管内皮细胞的凋亡,使肿瘤细胞因缺乏营养而死亡,从而达到抗肿瘤细胞生长及转移的作用。目前,虽然针对整合素αvβ3分子的拮抗剂的研究方兴未艾,但由于整合素家族成员的复杂性,仍缺乏与整合素αvβ3具高特异性的结合短肽或非肽试剂。噬菌体随机肽库展示载体技术在分离筛选可特异性与靶受体结合的小分子多肽方面已显示出巨大的应用潜力,也是研究蛋白与蛋白及其它配体受体相互作用位点的强有力工具。本研究拟应用噬菌体展示肽库技术,分别用合成多肽和培养细胞株作为筛选配基,通过常规的3轮筛选和改良的连续“亲和-消减-亲和”的筛选过程,获得的阳性克隆及合成短肽通过鉴定可与表达整合素αvβ3的细胞具高特异性结合活性。为选择肿瘤血管生成抑制导向治疗的载体,为体外合成基于整合素αvβ3的更为高效和特异肿瘤示踪相关的短肽药物提供理论基础。本研究由三部分组成:第一部分以多肽为筛选配基对噬菌体七肽库的筛选根据整合素αvβ3分子的晶体结构及其蛋白质序列,以决定其配体结合能力的分子区域的氨基酸序列为基础合成5条线性短肽,并分别以合成的5条生物素化的线性短肽作为筛选配基,对噬菌体随机七肽库进行固相淘选。每条多肽分别经过3轮亲和筛选后,测定其滴度。并从淘选后获得的克隆中各随机挑选10-20个克隆进行扩增,提取测序模板,以-96III引物通过自动测序测定其DNA序列,通过DNAMAN软件分析推断插入的随机七肽的氨基酸序列,并鉴定挑选的克隆与作为筛选配基的合成短肽的结合能力。结果:经过3轮淘选后,5条短肽均获得了与自己具较强结合活性的阳性克隆,经测序并推导其随机插入七肽序列,其中5号肽的筛选克隆中两个基序:****HRH,HWR****的出现次数较多。第二部分阳性克隆及合成多肽的鉴定及功能分析利用培养的M2和C23两种同一亲本来源的人黑色素瘤细胞(其中M2细胞与C23细胞之间的区别在于M2细胞经转染后稳定高表达整合素αvβ3分子),通过ELISA分别鉴定阳性克隆及合成多肽:“FITC-H L P W H R H,FITC-H W R L H P H”与αvβ3分子的结合能力。结果:5号肽具有基序“****HRH,HWR****”的克隆及不依赖于噬菌体的化学合成多肽均与M2细胞具有一定的结合活性,与C23不具明显结合活性。并且这种结合能被整合素αvβ3分子的配体纤维连接蛋白所抑制,抑制呈量效关系。第三部分删减筛选法筛选整合素αvβ3分子的特异结合肽为了改进包被过程中抗原表位由于分离及固定而发生改变的问题,我们设计以M2和C23两种人黑色素瘤细胞作为筛选配基,对噬菌体随机七肽库进行全细胞筛选。经过4轮亲和筛选,3轮删减筛选,经固定ELISA鉴定,结果表明随机选取50个克隆得到2个能特异性与M2细胞结合而不与C23细胞结合的阳性克隆,进行DNA测序后,其多肽序列如下:H T P P Y I L;M N F N A M L。并且P2与P5噬菌体与M2细胞的结合能被纤维连接蛋白所竞争抑制。