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目的： 通过原代培养并鉴定大鼠间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）；构建携带神经营养因子-3（Neurotrophin-3,NT-3）基因的慢病毒（Lentivirus,LV）载体；将构建成功的NT-3慢病毒载体转染MSCs，检测转染后MSCs内NT-3的表达；建立海人酸（Kainic acid,KA）大鼠颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy,TLE）模型；探讨NT-3基因修饰的MSCs脑内移植后对TLE的作用及其对大鼠海马苔藓纤维发芽（Mossy fiber sprouting,MFS）的影响。为基因治疗TLE提供实验依据和新思路，具有一定的临床应用价值和意义。 方法： 1.采用全骨髓贴壁法培养MSCs，用含10%FBS的低糖IMDM培养基作为细胞培养基培养MSCs。倒置显微镜下观察MSCs的生长形态，通过传代纯化和扩增，至P2代后进行分装冻存。 2.流式细胞仪鉴定P3代MSCs表面标志物CD90和CD105，造血干细胞标志物CD34和CD45的表达。 3.设计合成NT-3引物，采用RT-PCR的方法获得NT-3序列片段，然后将NT-3克隆到慢病毒载体中，重组质粒测序后进行抽提质粒，再进行慢病毒的包装与滴度测定。 4.将细胞分为3组：A组：LV-GFP-NT-3转染组；B组：LV-GFP转染组；C组：未转染组。测定慢病毒液对MSCs的最佳转染复数（Multiplicity of infection,MOI），以此转染细胞。倒置荧光显微镜下观察MSCs中绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的表达情况，计算转染率。MTT比色法检测LV-GFP-NT-3对MSCs增殖的影响。通过嘌呤霉素筛选后再进行扩大培养，得到稳定的细胞转染株。通过Western blotting、RT-PCR方法检测MSCs中NT-3的表达情况。 5.海人酸颞叶癫痫模型制备：利用立体定向方法建立大鼠TLE模型，在大鼠右侧海马CA3区注射KA以诱发TLE发作，按Racine癫痫发作分级标准评价动物发作级别，制作KA慢性TLE模型。 6.携带NT-3基因的MSCs移植、鉴定及对TLE的作用及可能作用机制探讨：将点燃成功的大鼠（即符合Racine分级3级以上发作的大鼠），随机分为3组：①对照组，在右侧海马CA3区注射生理盐水；②LV-MSCs组，相同区域注射空质粒转染MSCs；③NT-3-MSCs组，相同区域注射NT-3修饰的MSCs。各组大鼠注射后进行行为学和脑电图检测并用Timm组织化学染色法观察海马结构MFS。 结果： 1.大鼠MSCs分离培养成功，原代培养MSCs至第5d时可以传代。细胞传代后2~3d长至80%~90%融合。 2.流式细胞仪检测P3细胞表面抗原，结果显示：表达MSCs表面标记物CD90和CD105，不表达造血干细胞等的表面标记物CD34和CD45。 3.LV-GFP-NT-3质粒经Age I酶切电泳结果显示扩增出大小为818bp的NT-3和大小为969bp的基因片段，测序结果与NCBI公布的NT-3基因序列大小完全一致。慢病毒经包装、浓缩后，检测得到滴度为2×109TU/mL的LV-GFP-NT-3病毒液及滴度为2×109TU/mL的慢病毒空载体病毒液。 4.用LV-GFP-NT-3病毒液转染MSCs，转染48h后可在荧光显微镜下观察到GFP，最佳MOI为100，转染率为91.2%。MTT比色法检测LV-GFP-NT-3转染组增殖速度明显高于LV-GFP组（P＜0.05）和未转染组（P＜0.05）。用RT-PCR和Western blotting法分别检测转染后MSCs中NT-3mRNA及蛋白表达，LV-GFP-NT-3转染组明显高于LV-GFP组（P＜0.05）和未转染组（P＜0.05）。 5.颞叶癫痫大鼠的症状表现出明显的三个阶段：急性期，KA注射后很快出现局限性癫痫表现并逐渐发展为癫痫大发作；静止期，是急性期后的一段无症状期；慢性期，以反复出现自发性癫痫发作为特点并持续存在。脑电图在急性期和慢性期出现典型的癫痫大发作及发作间期表现。 6.将LV-GFP-NT-3移植到TLE大鼠侧脑室，对照组内观察无GFP表达，NT-3-MSCs组和LV-MSCs组中的冰冻切片可观察到移植细胞的GFP的表达，NT-3-MSCs移植组目的基因NT-3的蛋白表达高于LV-MSCs组和对照组；大鼠TLE的发作次数和发作级别较LV-MSCs组和对照组明显减低，脑电图中TLE的发作波幅较LV-MSCs组和对照组减小。Timm染色结果显示：在光镜下观察，发现在海马结构内，银颗粒沉积染色将苔鲜纤维染成棕黄或棕黑色。对照组和LV-MSCs组大鼠海马CA3区均可见到不同程度的Timm染色颗粒；NT-3-MSCs组大鼠海马CA3区内分子层及始层未见到或极少见到Timm染色颗粒，Timm染色颗粒较对照组和LV-MSCs组显著减少。 结论： 1.LV-GFP-NT-3载体构建成功，转染大鼠MSCs后，转染率高，且MSCs增殖迅速，能够过表达目的基因NT-3。 2.NT-3基因修饰的MSCs脑内移植对颞叶癫痫大鼠有抑制作用。 3.外源性补充NT-3可以改善颞叶癫痫灶的组织结构，抑制了海马MFS，表明NT-3对致痫后兴奋性神经环路重建有抑制作用。