目的：　　人们早已发现，小鼠和人类的精子中存在大量的RNA（包括mRNA，非编码长链RNA和非编码小RNA），并通过受精过程将它们带入卵母细胞和早期胚胎，并可能对受精和早期胚胎发育过程有一定的潜在作用。精子中的这些RNA，我们称之为精源性RNAs，这些精源性RNAs不仅包括来源于分化的生殖细胞的mRNA，还包括一些参与精子发生并能对精子发生过程中的基因表达进行调控的非编码小RNA分子，如小干扰RNA(siRNAs)，微小RNA(miRNAs)和piwi-互作RNA(piRNAs)。但迄今为止，人们对这些精源性RNA，特别是精源性非编码小RNAs(Small non-coding RNAs，SncRNAs)是否在受精和早期胚胎发育过程中发挥作用还存有疑问，对精源性SncRNAs在着床前胚胎发育过程中的作用机制也仍不清楚。　　目前人们已经基本阐明了两种非编码小RNA:微小RNA(miRNA)和内源性干扰小RNA(endo-siRNA)的经典生物合成、遗传途径及作用机制，并发现有两种关键的RNaseⅢ内切酶——位于细胞核微处理器中的DROSHA/DGCR8复合体和位于细胞质中的DICER，参与miRNA的加工合成。DROSHA能够识别来源于RNA多聚酶Ⅱ从一个miRNA基因位点或一簇miRNA基因形成的位点转录而成的长的初始片段的茎-环结构，然后联合DGCR8将带有茎环结构的初始miRNA转变成miRNA前体(Pri-miRNA)。和DROSHA不同的是，DICER不仅能够切割初始miRNA的茎-环结构而且能够切割外源性导入的或细胞自然产生的双链RNA使其转变成小RNA，如miRNA，siRNA和endo-siRNA。因而，敲除DICER能影响DICER依赖性的小RNA的生成，如miRNA和endo-siRNA的生成;而敲除DROSHA或DGCR8则能影响miRNA前体和成熟miRNA的生成。因此，本研究应用条件性敲除生殖细胞中的DICER和/或DROSHA的小鼠模型(Dicer cKO或Drosha cKO)，在生物学条件下敲除配子（精子细胞或卵母细胞）中的miRNAs和/或endo-siRNAs，结合卵胞浆内单精子注射技术（Intracytoplasmic sperm injection，ICSI）以研究精源性SncRNAs在受精及早期胚胎发育中的作用，同时运用高通量小RNA深测序及分子生物信息学手段分析比较条件性敲除精子细胞中的SncRNAs的组成及表达水平的变化，从更深层次上揭示精源性SncRNAs的作用与机制，从而为精源性SncRNAs是否可以作为临床男性不育症诊疗的指标提供新的理论依据。　　材料与方法：　　一、实验材料　　1、C57BL/6J背景的野生型小鼠、条件性敲除工具小鼠Stra8-iCre和ZP3-iCre和Loxp小鼠Dicerlox/lox、Droshalox/lox以及监测CRE重组酶的Rosa26-mTmGTg/Tg小鼠。　　2、小鼠基因型检测及免疫荧光检测相关试剂　　3、大、小RNA提取相关试剂　　4、卵胞浆内单精子注射及早期胚胎培养相关试剂　　5、实时定量PCR及单细胞PCR相关试剂　　6、小RNA深测序分析相关试剂　　二、实验方法　　（一）条件性敲除生殖细胞系中Dicer或Drosha的小鼠模型建立及繁育　　采用Cre-Loxp系统进行繁育。Stra8-iCre工具小鼠分别与Dicerlox/lox和Droshalox/lox小鼠进行繁育从而得到雄性生殖细胞条件性敲除Dicer或Drosha的小鼠。Zp3-iCre工具小鼠与Droshalox/lox小鼠进行繁育从而得到雌性生殖细胞条件性敲除Drosha的小鼠。　　（二）条件性敲除生殖细胞系中Dicer或Drosha的小鼠基因型检测　　敲除小鼠的基因表现型通过常规PCR的方法鉴定，大约在子代小鼠出生后10天左右剪尾巴后，提取小鼠基因组DNA，然后进行常规PCR扩增目的基因片段以鉴定基因的纯合、杂合或缺失。　　（三）小鼠睾丸重量、精子活动率及密度分析测定　　小鼠脱臼法处死后，用手术镊子和剪刀小心取出睾丸和附睾尾并放在无菌的滤纸上除去部分血管和脂肪，立即称重并在光学解剖显微镜下拍照。精子从附睾中取出后，使用计算机辅助分析仪进行活动率及密度的测定。　　（四）小鼠睾丸组织形态学及荧光化学分析　　小鼠睾丸于Bouins液中过夜固定，70％乙醇洗涤数次后再用石腊包埋成切块。用石腊切片机将包埋块切成5im超薄切片，然后进行Periodic-acid Schiff(PAS)染色后进行照相分析。小鼠睾丸用含4％多聚甲醛(PFA)的PBS溶液在室温固定3～4小时后，再在5～20％的梯度蔗糖溶液中洗涤后用1∶1的O.C.T和20％的蔗糖混合物包埋制成冰冻切片块，在冰冻切片机上切成10im的超薄切片进行荧光分析。　　（五）小鼠着床后胚胎的分离及其基因型检测　　脱臼处死怀孕雌鼠，打开腹腔用眼科剪刀和镊子小心分离双侧子宫系膜，在光学解剖显微镜下依次从子宫中切下胚泡，用眼科尖镊子小心的分开蜕膜，漏出胚胎，再用闭合的镊子尖将其轻轻剥离出来并用常规PCR检测其基因型。　　（六）卵母细胞及早期胚胎的免疫荧光分析观察　　将卵母细胞或胚胎用HEPES-CZB溶液润洗几次后置于含4％的多聚甲醛HEPES-CZB溶液中固定1小时，润洗3次后，将固定后的卵母细胞和胚胎转入含0.2％ TritonX-100的PBS溶液中放置15分钟，再转入封闭溶液（含2％BSA的PBS溶液）中封闭1小时，然后在第一抗体中孵育1小时，再转入荧光结合的种间特异性第二抗体中避光孵育1小时。最后用4，6-二脒基-2-苯基吲哚双乳酸盐(DAPI)进行复染色，用荧光显微镜（Zeiss，HAL100进行检测并照相。　　（七）精子和卵母细胞RNA抽提　　精子和卵母细胞中的大、小RNA抽提分别使用PureLinkTM RNA提取试剂盒和mirVanaTMmiRNA提取试剂盒，参照说明书进行。　　（八）实时定量反转录PCR　　RNA用DNA酶处理后，使用Invitrogen公司的反转录试剂盒对目标RNA进行逆转录，然后将获得的cDNA作为模板，并加入特异的引物，在SYBR Green发光混合酶复合物的监测下上机进行定量PCR。　　（九）卵胞浆内单精子注射(ICSI)　　在Piezo的脉冲驱动下将预先制备的单个精子头注射进MII期卵母细胞胞浆中，每次注射大约10～15个卵母细胞，注射完毕后，立即将其转移到矿物油覆盖的KSOM+AA培养液滴中，并置于37℃、含5％CO2的潮湿空气的二氧化碳培养箱中进行培养观察。　　（十）小鼠胚胎移植　　通常在胚胎移植的前一天晚上将用作代孕的CD-1（白色）雌性小鼠与输精管结扎的CD-1雄性小鼠进行合笼交配，第二天早晨检查交配情况，见有阴道栓的雌性小鼠即可用作当天的代孕母鼠，然后将发育至2-PN阶段或2-细胞阶段的胚胎在体视显微镜下移植到代孕雌性CD-1小鼠的单侧或双侧输卵管中。　　（十一）高通量单个细胞qPCR　　整个单细胞qPCR过程可分为两个部分，第一部分由反转录（RT）和特异靶片段扩增(STA)两个主要的过程组成。首先用反转录酶将单个细胞中的RNA反转录为cDNA，接着使用目的基因的96对引物的混合稀释液，进行特异片段的PCR扩增。第二部分，使用BiomarkTM HD系统(Fluidigm，South SanFrancisco，CA)，在96×96的芯片上进行特殊片段的qPCR反应，所得数据通过Biomark PCR实时分析软件读取。　　（十二）精子细胞中的小RNA的深层测序　　使用Ion总RNA序列套装建立小RNA的cDNA数据库。将提取到的小RNA绑定到离子编码序列上，用互补的反转录底物使离子编码退火来启动反转录过程，并通过ArrayScript反转录生成相应的cDNA。接着，将精子小RNA反转录来的cDNA通过Novex TBE/urea胶体系统(Invitrogen)进行大小筛选，再使用AmpliTaq DNA聚合酶进行扩增。这一过程通过Ion OneTouch(Invitrogen)配合Ion OneTouch模板套装(Invitrogen)来完成。获得的数据使用t-map离子连发校正仪(Invitrogen)对读取的序列进行校正，然后用Partek基因组套件(版本6.6 beta，Partek，St.Louis，MO)对校正后的读数进行分析。　　（十三）统计学分析　　研究中的所得数据采用卡方检验(Chi-Square)和SPSS16.0统计分析软件进行，P＜0.05定义为存在显著性差异，P＜0.01被认为存在极显著性差异。　　结果：　　一、生殖细胞敲除Dicer和/或Drosha小鼠的表型分析结果　　条件性敲除雄性小鼠生殖细胞中Dicer或Drosha后均导致小鼠精子发生障碍，表现为精子密度减少、精子活动率下降而致使小鼠不育。条件性敲除雌性小鼠生殖细胞中的Drosha后不影响卵母细胞的生成，但雌性小鼠表现出亚不孕现象。全身性敲除小鼠体内Drosha则导致小鼠于胚胎期7.5天死亡。　　二、Dicer或Drosha cKO小鼠精子细胞中Dicer和Drosha的mRNA表达水平分析结果　　相比野生型小鼠精子细胞，Dicer cKO小鼠精子细胞中的Dicer和Drosha的mRNA表达水平均显著性下降，而Drosha cKO小鼠精子细胞中的Dicer的mRNA表达水平未发生显著变化，Drosha的mRNA表达水平显著性降低。　　三、Drosha cKO小鼠卵母细胞中Drosha的mRNA及蛋白表达水平分析结果　　相比野生型小鼠卵母细胞，Drosha cKO小鼠卵母细胞中Drosha的mRNA表达水平显著性降低，但在Drosha cKO小鼠GV期卵母细胞中仍然可以检测到DROSHA截短蛋白(truncated protein)的存在。　　四、Dicer或Drosha cKO精子对卵母细胞受精及受精后发育的作用结果　　Dicer cKO和Drosha cKO精子通过ICSI均能使野生型小鼠卵母细胞受精并启动胚胎发育过程。但Dicer cKO精子的受精率极显著低于对照组，各阶段的胚胎发育率也极显著的低于对照组;而Drosha cKO精子的受精率和2-细胞胚发育率均正常，但当胚胎进一步发育到4-细胞阶段后，相比对照组胚胎发育率就开始极显著性降低(P＜0.01)。　　五、源于Dicer cKO和Drosha cKO精子的不同阶段胚胎的基因表达差异比较结果　　使用单细胞实时定量PCR对源于Dicer cKO和Drosha cKO精子ICSI后不同阶段胚胎的96个基因进行定量表达分析，与野生型精子相比，Dicer cKO精子和Drosha cKO精子ICSI后生成的胚胎中的很多支持胚胎发育的必需基因在不同的胚胎阶段出现了很大的表达差异。　　六、Dicer或Drosha cKO精子ICSI后的2PN和2-细胞阶段胚胎的组蛋白修饰水平变化结果　　免疫荧光显示Dicer或Drosha cKO精子ICSI后的早期胚胎（2PN和2-细胞阶段）中的组蛋白修饰水平未见显著性变化。　　七、Dicer cKO和Drosha cKO精子中非编码小RNAs（miRNAs和endo-siRNAs）深测序差异比较结果　　相比野生型小鼠精子，Dicer cKO和Drosha cKO精子中非编码小RNAs的构成比例未见显著性改变，但约有80％的miRNAs在Dicer cKO和Drosha cKO精子中的表达水平发生改变（上调或下调），约87％的endo-siRNAs的表达水平在Dicer cKO精子中发生改变，有61％的endo-siRNAs的表达水平在Drosha cKO精子中的表达发生改变。　　结论：　　1、全身性敲除小鼠细胞中Drosha会导致小鼠在胚胎期7.5天死亡。　　2、敲除卵母细胞中Drosha不影响卵母细胞成熟、生长、受精和早期胚胎发育，但会导致雌性小鼠的亚不孕(Sub-fertile)。　　3、条件性敲除小鼠生殖细胞中的Dicer或Drosha均导致雄性小鼠精子发生障碍而致使小鼠不育。　　4、精子缺失SncRNAs能够使正常卵母细胞受精，但会显著性降低受精率及早期胚胎发育率。　　5、条件性敲除精子中的Dicer或Drosha不会影响精子中各种小RNA的构成比例，但会改变miRNA和endo-siRNA的表达水平。