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目的：检测人腰椎间盘髓核细胞microRNA(miRNA)表达谱,筛选退变髓核细胞与正常髓核细胞差异性表达的miRNA,预测差异性表达miRNA的靶基因及信号通路；对显著性差异表达的miR-494和miR-513a-5p在人退变腰椎间盘组织中进行验证。为miRNA在人椎间盘退变发病机制中作用的研究提供实验基础。方法：1.分别获取腰椎退行性病患者手术取出的髓核组织3份和腰椎骨折患者髓核组织1份,分为退变组和正常组。采用酶消化法从髓核组织中分离出髓核细胞,后放置培养皿中培养。第一代细胞爬片至70%～80%融合时,将细胞爬片取出,对髓核细胞进行染色鉴定；提取标本总RNA,采用miRNA微阵列技术检测两组细胞中miRNA表达谱,筛选出差异表达的miRNAs;采用MicroCosm v5、TargetScan5.1和MICRORNA.ORG软件预测差异性miRNAs的靶基因；将差异基因或靶基因进行Gene Ontology (GO)分析；统计每个GO term中所包括的差异基因或靶基因个数,并用Fisher精确检验的统计方法计算每个GO term中差异基因或靶基因富集的显著性；后将得到的差异基因或靶基因进行Pathway显著性分析,分析每个Pathway中所包含的差异基因或靶基因个数,用超几何分布的统计检验方法计算出反映Pathway中差异基因或靶基因分布富集显著性的Pvalue,根据Pvalue大小找出与差异基因或靶基因功能显著相关的生物通路。2.分别获取腰椎退行性病患者手术取出的髓核组织5份和腰椎骨折患者髓核组织2份,分为退变组和正常组。手术取出标本后即刻保存于RNA保存液中,4℃保存过夜,取出后将髓核组织进行分离。首先将每个标本的一部分做病理切片、染色验证其退变性；然后另一部分标本采用Real-time qPCR技术对miR-494和miR-513a-5p差异性表达检测。包括RNA提取,miRNA反转录,实时荧光定量PCR；按照ΔΔCt解析法来进行实验设计,采用染料法(SYBR Green I)进行相对定量分析。结果：退变及正常的髓核细胞经过酶消化法分离、培养后均呈典型的髓核细胞形态。通过miRNA微阵列分析发现退变组中呈差异性上调的miRNAs有20种(miR-21*、miR-663、miR-29c*、miR-638、miR-572、miR-1225-5p、miR-513a-5p、 miR-101、miR-1275、miR-10b、miR-923、miR-195、miR-575、miR-181d、miR-494、 miR-765、miR-210、miR-497、miR-483-5p、miR-345)。其中,miR-513a-5p和miR-494呈显著性高表达,Ratio值分别为2.2222和2.9485；综合三种软件MicroCosm v5、TargetScan5.1和MICRORNA.ORG预测得出miR-513a-5p和miR-494的靶基因分别为MKK4和JunD,此两种靶基因均参与JNK信号通路,且两个靶基因在此通路中均显著上调。通过对病理切片和染色证实了退变和正常髓核组织的特点；通过Real-timeqPCR技术检测显示退变组中miR-513a-5p与miR-494较正常组均呈现明显的高表达,差异倍数2-ΔΔα值分别为47.3660±39.0525和13.5560±7.9860(P<0.05),差异具有统计学意义,两种miRNA高表达的差异倍数较基因芯片筛选结果更为明显。验证了微阵列差异基因筛选结果的可靠性和准确性。结论：本研究首次通过miRNA微阵列技术对人腰椎间盘髓核细胞进行了miRNA表达谱分析,筛选出退变椎间盘中差异性表达上调的miRNAs共20种,其中miR-513a-5p和miR-494呈现非常显著性上调；预测出miR-513a-5p和miR-494对应的靶基因MKK4和JunD,及其可能共同参与并发挥作用的信号传导通路JNK通路；Real-time qPCR实验技术验证了miR-513a-5p和miR-494在退变髓核组织中的同样呈现显著性差异高表达,与微阵列筛选结果完全一致。为进-步在基因水平研究椎间盘退变的发病机制获得了新的突破口,为将来可能实现的基因诊断、基因干预治疗以及疾病的预防奠定一定的实验基础。