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第一部分低氧微环境加放疗对Hep-2细胞系CD133+细胞的富集作用目的：观察体外低氧和常氧培养下喉癌Hep-2细胞系在放疗前后CD133+细胞比例及生长抑制率的变化，探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用。方法：体外常氧和低氧环境下培养人喉癌Hep-2细胞，分别给予不同剂量的射线照射，检测各组细胞放疗后不同时间细胞生长抑制率和CD133+细胞比例的变化。结果：常氧组各个剂量和时间点的生长抑制率均高于低氧组，24小时、10Gy时差异最大，具有显著性（P<0.05）。放疗后CD133+细胞低氧和常氧组均有不同程度的富集，低氧组在各个剂量和时间点的CD133+细胞比例均高于常氧组，24小时、10Gy时差异最大，具有显著性（P<0.05）。结论：喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用，并提示阻断低氧因素可能会增强喉癌的放疗敏感性。第二部分喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中作用机制目的：探讨肿瘤干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用机制。方法：体外培养人喉癌Hep-2细胞和HIF-1α沉默的Hep-2细胞，分别用流式细胞仪分选出CD133+细胞，并分别在低氧和常氧条件下行无血清培养，由此分为四组:（1）低氧培养的CD133+细胞为A组；（2）常氧培养的CD133+细胞为B组；（3）低氧培养的HIF-1α沉默的CD133+细胞为C组（4）常氧培养的HIF-1α沉默的CD133+细胞为D组。各组细胞分别给予不同剂量的照射，照射后不同时间行MTT检测。行软琼脂克隆形成实验，并给予10Gy照射，14天后观察四组细胞克隆形成率。四组细胞分别给予10Gy照射，24小时后用流式细胞仪分别检测DNA-PKcs、ATM、Survivin、P53的表达。结果：流式细胞仪分选后获得CD133+细胞纯度是92.8%和94.1%，CD133+细胞B、C、D三组放疗后各个剂量和时间点的生长抑制率均高于A组。放疗前后CD133+细胞克隆形成率均高于CD133-细胞。A组的克隆形成率均明显高于B、C、D组（P<0.05）。A组放疗后DNA-PKcs、Survivin表达均较其余三组高（P<0.05），而ATM、P53表达无明显差别（P>0.05）。结论：喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中有重要作用，其放疗抵抗的机制是通过激活以DNA-PK为主的NHEJ和以ATM为主的HR两种途径来修复损伤的DNA，而低氧导致的喉癌干细胞放疗抵抗能力的增强则主要是通过DNA-PK的活性增强实现的。第三部分喉癌干细胞对低氧介导的喉癌放疗抵抗作用的动物实验目的：通过观察喉癌干细胞在裸鼠体内成瘤情况，及放疗后肿瘤内的CD133+细胞比例、各种蛋白表达情况，进一步证实喉癌干细胞在低氧介导的喉癌放疗抵抗中的作用。方法：取HIF-1α沉默和未沉默的CD133+细胞分别注入裸鼠背部皮下成瘤，成瘤后，随机将12只裸鼠分为4组：HIF-1α未沉默放射组（A组），HIF-1α未沉默对照组（Ac组）HIF-1α沉默放射组（B组）、HIF-1α沉默对照组（Bc组）,每组3只。2周后A组和B组给予10Gy放疗，Ac组和Bc组给予0Gy。每隔2日测量肿瘤大小，2周后杀鼠取瘤，测肿瘤重量，计算抑瘤率，测CD133+细胞比例，和DNA-PKcs、ATM、P53、Survivin蛋白的表达。结果：CD133+细胞只需4000-10000就能成瘤。放疗后抑瘤率A组较B组低（P<0.05）；CD133+细胞比例放疗组均大于相应对照组，A组大于B组（P<0.05）。DNA-PKcs、ATM、P53、Survivin蛋白的表达放疗组均大于相应对照组（P<0.05），DNA-PKcs、Survivin表达A组大于B组（P<0.05），而ATM、P53的表达A组和B组无明显差异。结论：CD133+细胞对放疗有抵抗作用，其放疗抵抗的机制是通过激活NHEJ和HR两种途径来修复损伤的DNA，而低氧导致的其抵抗能力的增强则主要是通过DNA-PK的活性增强和干细胞数量增多实现的。