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在诱抗剂HI能够提高水稻R6耐盐能力的基础上,本实验针对水稻R6诱导耐盐相关基因P450作为研究的目标基因,通过“功能基因扩增多态性”(FGAP)标记方法,分析基因组DNA与转录后基因表达(cDNA序列)的多态性,并对特殊的条谱进行凝胶回收测序,分析其特异性。实验主要结果如下:
1.药物处理下的水稻形态表现
与H2O对照相比,盐胁迫下水稻的根长受到了明显的抑制,根色发黄,短而粗,苗高比亲本要矮小。与1%NaCl胁迫相比,经过诱抗剂HI预处理后,根长得到了诱导,根色变白,比水的粗比盐的细,苗高分别介于同一类型植株H2O和盐处理之间。与盐胁迫对照相比,红霉素、西咪替丁抑制苗高和根长,利福平促进苗高抑制根长,环孢素A促进根长且幼苗比盐处理稍高。
2.采用六种方法提取DNA,结果显示液氮研磨法、SDS法、CTAB法所得的基因组DNA效果较好,但在DNA浓度上明显小于优化SDS法;优化CTAB法所提取的基因组DNA虽然浓度较大,但纯度较差,拖尾较严重;试剂盒提取得到的基因组DNA纯度高,DNA量也很充足,并且没有RNA污染。
3.不同处理的P450基因cDNA序列多态性分析
3.1反应体系的优化结果。本文改良了陈晓[79]的反转录体系,将Oligodt引物量由2μl改为1μl,同时在反应条件中增加了25℃温浴10min后再进行42℃的恒温反应,得到的反转录产物更为完整,actin引物检测时得到的特异条带更亮更集中。针对cDNA的PCR反应体系特点,进一步改良了朱志凯[74]和陈晓[79]的PCR反应体系,根据条带重新优化体系,包括反应体系的成分用量以及反应条件。最终优化PCR反应体系:20μl PCR反应体系中,含60ng模板cDNA,1μl20mM dNTP,0.5 U TaqDNA聚合酶,2.5μl10pM随机引物和3.5μL10pM特异引物,复合退火温度为随机引物35℃,特异引物55℃。
3.2对目的基因的退火温度及循环数的筛选,T2、T7、T15、P7、P8、P9、P11、P15的最佳退火温度分别为58℃、55℃、55℃、58℃、55℃、58℃、58℃、58℃,最佳循环次数分别为34、32、32、34、34、36、34、32。
3.3筛选引物组合。筛选与光合速率显著相关的组合进行基因组以及cDNA序列多态性检测,共筛选出30对引物组合,分别对水稻R6三种处理(清水、盐及HI)条件下提取的DNA进行扩增及RNA进行RT-PCR扩增,产生多态性条带242条,多态性达75%,大多数条带集中在100-600bp。
3.4聚丙烯酰胺凝胶电泳回收。改进了聚丙烯酰胺凝胶回收的方法,将煮沸法融合到一步法中,用特异引物T7和T2扩增,得到了158bp和226bp两条清晰条带。
4.在盐胁迫条件下CsA诱导水稻NM001066006基因发生选择性剪接。本实验首次发现用一种功能基因扩增多态性(Functional Genes Amplified Polymorphism,FGAP)方法中的组合引物对P3P2,进行cDNA序列扩增,在CsA作用下,简便有效地区分NM_001066006和NM_001066009的表达,并对图11,12中约530 bp条带是在NM_001066006中处于195 bp内含子,而在NM_001066009中却处于102 bp外显子作出合理的解释,可见水稻P450基因对药物CsA有明显作用,因而在水稻中利用CsA研究P450基因、MDR基因与抗逆性的相互作用值得深入探讨。而FGAP为mRNA选择性剪接的研究提供了一个简便有效方法。
5.对19450基因特异条带回收测序分析。回收条带进行PCR扩增,由上海英俊生物技术有限公司测序,测序结果显示,用H2O、S、HI处理后,不同处理的cDNA序列与NM_190966相同的碱基占70%;在NM_190966基因编码序列1042bp处,清水和HI处理的水稻R6材料发生了一个碱基的缺失;在NM_190966基因编码序982-1458处,水稻R6材料发生了65个碱基变异,其中AC1079CA明显是颠换的结果;但有8个碱基是在盐胁迫下发生改变,经过HI处理后有33个碱基发生了改变,测序结果分析与电泳基本一致。这种现象是水稻R6个体间DNA差异或是盐胁迫与诱抗剂HI诱导作用产生的RNA编辑的结果?有待进一步研究。