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背景戈谢病（Gaucher Disease,OMIM 606463）是一种相对常见的溶酶体贮积病,呈常染色体隐性遗传。是由于GBA基因发生突变引起溶酶体内β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase,GBA,EC 3.2.1.45）活性显著降低或缺乏而致病。β-葡萄糖苷酶的作用是将底物葡萄糖脑苷脂水解成葡萄糖和神经酰胺,当该酶活性降低或缺乏时,大量的底物沉积于溶酶体内,造成多器官的损伤,主要表现为肝脾肿大、骨病和神经系统症状。戈谢病的临床表现轻重差异较大,轻者可无症状,重者可在围产期致死。根据神经系统是否受累,戈谢病的临床表型可分为3种:I型（非神经型/慢性型）、II型（急性神经型/神经型）、III型（亚急性神经型/神经型）。在犹太人群戈谢病患者中,I型最为常见,各个年龄段均可发病,多在学龄前儿童发病,没有神经系统受累的表现;II型戈谢病常在婴儿期发病,病情严重,可表现为迅速进展的癫痫发作、角弓反张等神经系统症状,可在2岁前死亡;III型戈谢病早期表现为脏器的损伤,后逐渐出现神经系统症状。戈谢病在世界各地均有发病,但其发病率具有明显的种族差异性。据估计,戈谢病在普通人群中的发病率为1/50,000-1/100,000,在犹太人群中的发病率最高,为1/500-1/1,000。外周血白细胞或培养的皮肤成纤维细胞GBA酶活性的检测是诊断戈谢病的金标准。当外周血白细胞或皮肤成纤维细胞中GBA酶活性明显降低至正常均值的30%以下时,即可诊断为戈谢病。随着检测技术的提高,以干血片为载体的GBA酶学测定在戈谢病的筛查及诊断中逐渐普及应用,为新生儿及高危戈谢病患者的筛查提供基础。此外,GBA基因突变分析可从分子水平进一步确诊戈谢病。GBA基因跨度7.6kb,位于1q21,有11个外显子,10个内含子,转录一条长2387bp的mRNA,开放阅读框为1611bp,编码536个氨基酸的多肽链。在同一染色体距GBA基因下游16kb的位置,存在一个跨度5.5kb,同源性达96%的假基因（GBAP）,真假基因可发生同源重组导致致病突变产生。根据人类基因突变数据库HGMD（Professional 2016.2）报道,GBA基因突变共437种,包括点突变、剪接突变、小缺失小插入突变、基因重排,其中以点突变最常见,约占75.7%。GBA基因的突变谱存在种族及地域的差异,在犹太人群及高加索人群戈谢病患者中,N370S、84GG、L444P、IVS2+1G>A这4种突变最为常见,分别占戈谢病患者GBA基因突变的97%及75%。而在亚洲人群戈谢病患者中,L444P、F213I、RecNciI这3种突变最为常见。戈谢病临床表型与基因型间的关系尚未十分明确。N370S和N188S突变与I型戈谢病有关,L444P/RecNci I基因型与II型戈谢病有关,L444P纯合型突变与III型戈谢病有关。戈谢病临床表型与基因型间的关系的研究,可为患者的疾病预后评估、治疗和遗传咨询提供帮助。戈谢病的特异性治疗方法有酶替代疗法、底物减少疗法、分子伴侣治疗法、造血干细胞移植治疗、基因治疗。酶替代治疗是临床采用的主要治疗方法。目前,在我国上市的药品是注射用的伊米苷酶（Imiglucerase）,酶替代治疗能显著改善患者的临床症状,提高患者的生活质量,只对未涉及神经病变的I型戈谢病有效,但不能预防或改善中枢神经系统损伤,且治疗费用昂贵,普及率不高;底物减少法治疗在美国已经批准上市的药物有美格鲁特（Miglustat,Zavesca）,它是一种对I型戈谢病患者有效的口服药,虽然可透过血脑屏障,但临床上并没有观察到它对II型及III型戈谢病患者有效;近几年学者对分子伴侣治疗方法的研究较多,研究发现分子伴侣药物不仅能有效改善患者的临床症状,而且对神经系统症状有改善作用,因为该药物可以穿过血脑屏障,是目前解决戈谢病神经组织病变问题最有前景的治疗方法。研究表明,针对不同的突变,分子伴侣药物的治疗效果不同,如脱氧野尻霉素类药物可使N370S突变的GBA酶活性提高至6.2倍,而IFG类药物可使L444P突变的GBA酶活性提高至3.5倍。因此,寻找针对不同突变的最合适的分子伴侣药物是目前戈谢病药物治疗研究的突破点。造血干细胞移植治疗风险较大,国际上对该治疗方法报道极少。基因治疗仍在动物研究阶段。对于戈谢病GBA基因突变特点的了解,多数来自于欧洲和美国等国外学者的文献报道,除韩国和日本学者对戈谢病GBA基因突变特点进行了报道,其它亚洲地区的国家对戈谢病的研究报道较少,我国对戈谢病的相关研究也非常缺乏。自1985年Sorge等成功克隆出人类GBA基因cDNA片段以来,科学家不断深入探索了GBA基因突变对蛋白酶结构和功能的改变及突变蛋白加工修饰过程中的异常。我国对戈谢病的分子发病致病机制的研究较晚,新突变的功能学验证资料更是少见。因此,分析戈谢病患者GBA基因突变特点,对新突变致病性进行功能学验证,探讨戈谢病患者临床表型与基因型间的关系是十分有意义的。目的分析22例中国戈谢病患者GBA基因的突变特点,对GBA基因新突变进行体外功能学鉴定,并探讨戈谢病临床表型与基因型间的关系。方法2010年1月至2015年12月广州市妇女儿童医疗中心内分泌与遗传代谢科根据外周血白细胞GBA酶活性检测确诊戈谢病患儿共22例,来自中国南方地区（广东省、湖南省、江西省、贵州省）,均无血缘关系,其中男15例,女7例。提取患者外周血基因组DNA,采用巢式PCR的方法对GBA基因的11个外显子及外显子两端的侧翼序列进行基因突变分析,对新突变进行多物种突变氨基酸的保守性分析,并利用SIFT及Polyphen-2软件预测新突变的致病性,利用人GBA蛋白晶体结构同源建模,使用PyMOL及Discovery Studio软件标记突变位点在蛋白三维结构中的位置及分析其对蛋白结构的影响。建立GBA基因体外真核表达体系,把pcDNA3.1-EGFP作为空载体,构建pcDNA3.1-GBA-EGFP野生型载体,然后再体外定点诱变成相应的突变型载体,转染COS-7细胞后提取细胞总蛋白,采用荧光法对GBA酶活性及参考酶β-半乳糖苷酶活性进行检测,并进行Western blot蛋白印迹分析,对新突变进行功能学验证。通过结合基因突变特点及患者临床信息,探讨戈谢病患者临床表型与基因型间的关系。结果1.本研究22例戈谢病患者的诊断年龄5个月-69岁,<3岁的患者占63.6%（13/22）。患者的外周血白细胞GBA酶活性明显降低,为2.05±1.49 nmol/mg/h,除4例戈谢病患者的壳三糖苷酶活性为0 nmol/ml/h,其余患者的壳三糖苷酶活性均显著升高,为5916.93±4635.75 nmol/mg/h。22例戈谢病患者中,I型19例,II型3例,没有发现III型患者。I型患者中,63%（12/19）的患者在2岁内起病,且表现为严重的脾大,贫血、血小板降低等,26%（5/19）的患者3岁前死亡。II型患者均在婴儿期发病,2岁前死亡。本研究有6例基因型为L444P/L444P的I型患者,早期发病,病情严重;有9例基因型为L444P复合杂合型的I型患者,其临床表现存在轻重差异;有2例基因型均为L444P/RecNciI患者,临床分型均为II型。2.本研究的44个GBA等位基因均检测出（检出率为100%）,共检出18种不同的突变,包括14种已知致病突变（F37V、L96P、R120W、M123V、L264I、R359Q、Y363C、V375L、D409H、L444P、R496C、RecNci I、IVS2+1G>A、IVS6-1G>C）和4种新突变（Y22C、F109L、L149F、c.983990delCCCACTGG）。突变L444P最常见,突变率为47.7%,其次为RecNciI（6.8%）。新错义突变Y22C、F109L、L149F及功能未知的已报道突变L96P的突变氨基酸在12个不同物种中高度保守,且SIFT评分均接近0,Polyphen-2评分均接近1。GBA蛋白结构分析提示Y22C突变可使糖基化位点N19附近的蛋白空间结构发生改变;L96P、F109L、L149F突变位点均位于催化区域,可影响蛋白催化结构的形成。3.空载体、野生型及突变型载体转染COS-7细胞72小时后,荧光显微镜观察可见各组细胞均显示明亮绿色荧光,Y22C、L96P、F109L、L149F突变型载体表达GBA酶活性明显降低。Western blot蛋白印迹分析结果提示,Y22C、L96P、F109L、L149F突变型载体GBA蛋白表达量均有不同程度的减少。结论1.本研究丰富了GBA基因的突变谱。通过GBA基因分析,本研究共检测出18种不同的突变,其中有4种新突变（Y22C、F109L、L149F、c.983990delCCCACTGG）。L444P为热点突变,突变率为47.7%,其次为RecNciI（6.8%）。2.构建了GBA基因体外真核表达载体,经COS-7细胞瞬时表达实验验证,新突变Y22C、F109L、L149F为致病性突变,同时为新突变功能学研究及分子致病机制提供基础。3.本研究发现L444P纯合型患者与重症的I型戈谢病有关。L444P复合杂合型患者临床症状的严重程度常与其携带的另一个杂合基因的严重程度密切相关。L444P/RecNciI基因型与II型戈谢病有关。