在全球范围内,伴随着人口老龄化的加剧,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)的发病率和患病率快速增加。β淀粉样蛋白(β-amyloid protein, Aβ)在AD发病中起到关键性的作用,最终导致的结果是神经元的大量丢失,尤其是突触前神经元；与此同时,突触前的烟碱受体(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)也显著减少。有研究发现,Aβ蛋白与α7nAChR具有高度亲和力,Aβ蛋白在神经元内的沉积和损伤作用可能与此有关。目前,在AD的治疗中,胆碱酯酶抑制剂是最为重要的药物之一,其通过减少激动剂乙酰胆碱的分解,间接升高乙酰胆碱浓度起作用；然而,其疗效随作用时间的延长逐渐消失,最后无异于安慰剂。同样作为激动剂,烟碱受体激动剂短期应用具有神经细胞的保护作用,长期应用其保护作用不确定；一般认为,烟碱受体拮抗剂短期应用无神经细胞保护作用,而长期应用的研究报道较少。AD与慢性心衰都具有受体过度激活、受体下调和细胞凋亡等共同特征,所以二者可能具有一定的可比性。β受体激动剂短期内应用可以改善心衰的症状,但是长期应用使症状恶化和增加死亡率；而p受体阻滞剂却完全相反,已成为心衰治疗最为重要的手段之一。既然长期应用激动剂治疗AD存在上述问题,那么长期应用拮抗剂是否有可能发挥作用?故本研究从PC12细胞(类神经元)和神经元的实验出发,探讨长时间应用α7烟碱受体拮抗剂是否具有对抗Aβ蛋白的损伤作用,并了解其作用机制。第一部分烟碱受体激动剂和拮抗剂对Aβ蛋白诱导PC12细胞损伤的影响目的观察长时间应用烟碱受体激动剂和拮抗剂对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤的干预作用,探讨α7烟碱受体拮抗剂远期的细胞保护作用。方法1.用Aβ25-35制作PC12细胞的损伤模型,以α7烟碱受体拮抗剂(甲基牛扁亭碱)和烟碱受体激动剂(尼古丁)进行干预。2.实验分组：对照组, Aβ25-35组,尼古丁+Aβ25-35组,甲基牛扁亭碱+Aβ25-35组。3.MTT法检测药物+Aβ25-35作用于PC12细胞36、48、60、72、84h的细胞活力。4.根据MTT结果,分别于药物+Aβ25-35处理36和84h后,采用Hoechst染色、流式细胞仪检测PC12细胞的凋亡。结果1.随着作用时间的延长,甲基午扁亭碱组的细胞活力相对地逐渐增加,尼古丁组的细胞活力相对地逐渐下降。2.随着作用时间的延长,甲基牛扁亭碱表现出抑制凋亡的趋势,而尼古丁抑制凋亡的作用消失。结论甲基牛扁亭碱短时间内应用未表现出PC12细胞的保护作用,但因为其具有阻断Aβ蛋白与α7nAChR结合的功能,故最终产生细胞保护作用的趋势。尼古丁短时间应用具有细胞保护作用,可能与其通过其它途径对抗Aβ蛋白损伤有关；但是随着作用时间的延长,Aβ蛋白的损伤作用占据了优势,最终其细胞保护作用丧失。第二部分烟碱受体激动剂和拮抗剂对Ap蛋白诱导损伤的PC12细胞烟碱受体功能的影响目的观察长时间应用烟碱受体激动剂和拮抗剂,在影响Ap蛋白诱导损伤PC12细胞的基础上,探讨其对PC12细胞nAChR功能的作用。方法1.分组同前。2.分别于药物+Aβ25-35处理后36和84h进行检测。首先洗脱所作用的药物,然后采用Fluo 3/AM对钙离子进行染色,用激光共聚焦显微镜检测细胞内基础钙离子浓度和刺激后细胞内钙离子浓度的变化。结果1.在36h,Aβ25-35引起钙超载；在84h,可能由于PC12细胞损伤进一步加重,其基础钙离子浓度反而降低；同时,其nAChR的功能一直是显著降低的。2.在36和84h,甲基牛扁亭碱均具有减轻钙超载的作用；同时,还增强了nAChR的功能,在84h其增强nAChR功能的作用显著优于尼古丁。3.在36和84h,尼古丁均不具有抑制钙超载的作用,在后期促进了钙超载的发生；尼古丁一直具有增强nAChR的功能,但是在后期其作用弱于甲基牛扁亭碱。结论甲基牛扁亭碱抑制Aβ蛋白引起的PCI2细胞钙超载,并且可能通过细胞保护作用或者上调nAChR,最终增强了nAChR的功能。尼古丁不具有抑制Aβ蛋白引起的钙超载,甚至在后期促进了钙超载的发生；尽管一直具有增强nAChR功能的作用,可能与其通过其它途径产生细胞保护作用或者上调nAChR有关,但是在后期其作用已经弱于甲基牛扁亭碱。第三部分烟碱受体激动剂和拮抗剂对Ap蛋白诱导PC12细胞损伤的影响机制目的从α7nAChR数量的调节和影响凋亡的信号转导通路方面,探讨α7烟碱受体拮抗剂产生PC12细胞保护作用的机制。方法1.分组同前。2.分别于药物+Aβ25-35处理后36和84h进行检测。JC1染色检测线粒体膜电位,qRT-PCR检测bcl-2、bax和Caspase 3的mRNA表达,Western Blot检测bcl-2、bax和α7nAChR的蛋白表达。结果1.Aβ蛋白的损伤作用以及尼古丁和甲基牛扁亭碱对Aβ损伤作用的干预均与线粒体凋亡途径有关。2.在36和84h,α7nAChR和Bax表达显著正相关,可能提示α7nAChR介导了Aβ25-35对PC12细胞的损伤；甲基牛扁亭碱和尼古丁均能下调α7nAChR蛋白表达。3.在36和84h,甲基牛扁亭碱均抑制caspase 3的mRNA表达；在84h,增加bcl-2/bax的mRNA表达。而尼古丁对bcl-2/bax的mRNA表达无显著影响,在84h增加了caspase 3的mRNA表达。4.在36和84h,甲基牛扁亭碱显著增加bcl-2/bax的蛋白表达,尼古丁对bcl-2/bax的蛋白表达无显著影响。结论Aβ蛋白可能通过α7 nAChR介导对PC12细胞的损伤,甲基牛扁亭碱通过下调α7nAChR,并阻断Aβ蛋白的损伤作用,进而升高bcl-2/bax,降低Caspase 3的表达,最终抑制PC12细胞的凋亡。第四部分在大鼠神经元中验证烟碱受体激动剂和拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤作用的影响目的为了验证PC12细胞的实验结果,采用体外培养大鼠神经元进一步观察烟碱受体激动剂和拮抗剂对Aβ蛋白诱导损伤的影响。方法1.用Aβ25-35制作神经元的损伤模型,以α7烟碱受体拮抗剂(甲基牛扁亭碱)和烟碱受体激动剂(尼古丁)进行干预。2.分组同前。3.MTT法检测药物+Aβ25-35作用于大鼠神经元第3、7、14、21d的细胞活力。4.根据MTT结果,在Aβ25-35+药物作用于大鼠神经元21d检测细胞的凋亡和坏死。结果1.在实验早期(第3和7d),尼古丁具有增加细胞活力的作用；在实验后期(第21d)甲基牛扁亭碱表现出增加细胞活力的作用,而尼古丁的作用消失。2.在实验早期(第3和7d),尼古丁显著抑制细胞凋亡和坏死；在实验后期(第21d),甲基牛扁亭碱表现出显著抑制细胞凋亡和坏死的作用,而尼古丁的作用消失。结论烟碱受体拮抗剂甲基牛扁亭碱在短期内并不具有神经元的保护作用,但是长期应用其保护作用显现出来,表现为明确地抑制神经元凋亡和坏死的作用；而烟碱受体激动剂尼古丁在短期内应用具有神经元保护作用,但是长期应用其保护作用逐渐丧失。