论文部分内容阅读
由草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reo virus, GCRV)引发的草鱼出血病一直是制约草鱼养殖业可持续健康发展的一大难题。要解决这一难题,就必须从引发该病的分子遗传调控机理的研究入手,找到草鱼发病后鱼体自身的抗病机制。近年来,关于microRNA (miRNA)领域的研究受到广泛关注。大量研究证实miRNA与生物的生长、发育、代谢、疾病的发生、发展以及诊断治疗密切相关。本研究选择草鱼和与之同属的抗病力强的赤眼鳟为研究对象,对草鱼和赤眼鳟在正常和感染GCRV下,分别采集了草鱼和赤眼鳟的胸腺、头肾、中肾、鳃、肝脏、脾脏、肌肉7个组织的混合样本运用第二代miRNA高通量测序筛选品种间的差异表达的miRNA,并利用生物信息学分析手段对其进行靶基因的预测和富集性分析,找到差异表达的miRNA及其靶基因,以及基因之间的调控网络,揭示草鱼出血病miRNA的分子调控机制,为草鱼与赤眼鳟的抗病杂交育种提供理论依据。主要研究结果如下：1.草鱼和赤眼鳟miRNA Solexa测序构建了草鱼和赤眼鳟的小RNA文库。草鱼miRNA文库经测序得到可用于比对的序列(valid reads)共计8,834,873条,占raw reads数的61.36%,unique序列153388条,占unique总数的30.2%。赤眼鳟小RNA文库经测序得到可用于比对的序列(valid reads)共计9,381,928条,占raw reads数的77.50%；其中unique序列218,619条,占unique总数的39.42%。根据clean数据的总数和种数的长度分析,大部分数据长度在20-24nt之间。基于miRBase 21.0进行比对分析,共检出929个前体miRNA序列,1122个成熟体miRNA序列。其中新发现的miRNA 545条,已知前体对应的未见报道的3’或5’端成熟体miRNA81条。新发现的miRNA占。unique miRNA,总数的55.79%。与已报道的鱼类miRNA序列完全一致的序列占总数的14%,异构表达的序列(isomiRNA)占总数的30.2%。2.草鱼和赤眼鳟miRNA的差异表达分析miRNA差异分析结果显示：有562个共表达的序列,560个差异表达序列,各占检出序列总数的50%,差异表达水平显著的miRNA有558条。大部分差异表达miRNA处于极显著水平(P<0.01)。两种鱼中预测候选的miRNA大部分为中低表达。对检出的miRNA进行聚类分析,共检出84个基因簇,包含了311条miRNA。在染色体scaffold_LG38上分布了一个由13个miRNA组成的脊椎动物中保守性较高的miR-17-92基因簇。检出的草鱼和赤眼鳟的miRNA与在miRBase数据库中已收录的斑马鱼的miRNA可比对上的条数最多,为277条。共鉴定了128个保守性miRNA家族,其中100个属于miRBase数据库中已公布的miRNA家族。统计发现let-7家族在进化关系上的保守性最高。一共发现了10个let-7家族成员,其中let-7h家族目前只在鱼类中被发现,说明let-7h是在鱼类中高度保守的miRNA家族。3.差异表达miRNA的荧光定量PCR验证、靶基因预测及生物信息学分析随机选择了15条检出的miRNA进行荧光定量PCR验证,其中11条与高通量测序的差异表达水平一致。对差异表达的558条miRNA进行目标基因的预测,其中413条能够锚向靶基因,共预测了8572个基因。从预测结果中筛选到与已报道的草鱼出血病相关的靶基因有12个,与免疫相关的靶基因30个。通过富集分析发现16条显著的KEGG通路,其中7条达到P<0.01极显著水平；GO富集分析发现差异显著的121条,其中25条达到了P<0.001极显著水平。这些通路和GO条目都与细胞增殖、分化、转化及凋亡以及疾病相关。综合以上结果表明。在感染GCRV的条件下,激起了鱼体自身的免疫应答反应,两种鱼类中的miRNA表达水平差异显著,说明草鱼与赤眼鳟在GCRV的刺激下存在明显不同的miRNA调控机制,这可能是在攻毒后两种鱼表现出不同抗性的根本原因。