论文部分内容阅读
丹参是我国的一种传统中药,丹参有效成分包括脂溶性的丹参酮和水溶性的丹酚酸。其中,二萜类的丹参酮在抗氧化、消炎抑菌及抗肿瘤等方面具有显著疗效;丹酚酸是目前已知的抗氧化作用最强的天然产物之一,在治疗许多心脑血管疾病上疗效显著。但是,由于野生丹参资源濒临灭绝、栽培丹参品质严重退化和生长周期长。目前丹参原料药已供不应求。利用基因工程手段提高丹参中丹参酮含量和丹酚酸含量是切实可行的途径之一,而丹参的代谢调控方面的研究日趋成为丹参研究的重点,因此本研究将为丹参代谢工程的开展提供一定的前提和基础。已有的研究表明,植物中特有的AP2/ERF类转录因子参与了许多次生代谢调控过程并在逆境胁迫和激素应答中有重要作用,本研究以已经报道的在萜类代谢调控中具有重要作用的长春花ERF类转录因子Cr ORCA3作为电子探针,通过本地Blast获得两条ERF类转录因子Sm ERF2和Sm O3L3,从基因克隆、进化分析、表达分析、启动子分析、转基因植物功能验证和转基因植物灰霉菌抗性等方面开展了一系列的工作。目前取得的成果如下:1.通过3’RACE的方法获得Sm ERF2和Sm O3L3的ORF全长序列,通过生物信息学分析发现Sm ERF2和Sm O3L3均只含有一个AP2结构域,属于AP2/ERF转录因子中的ERF亚家族;与拟南芥ERF亚家族的ERF转录因子比较,Sm ERF2与At ERF2亲缘关系最相近,此外,Sm ERF2与已经报道的在青蒿中与青蒿素合成相关的Aa ERF1转录因子有比较近的亲缘关系暗示Sm ERF2可能参与丹参中的次级代谢物的合成,Sm O3L3与At RAP2.6L(ERF113)最相近。2.组织表达分析表明,Sm ERF2和Sm O3L3均在在茎和叶中表达最高且须根要比主根高,叶柄中最低,但是Sm ERF2各组织间的表达差异要明显比Sm O3L3小。诱导表达分析表明Sm ERF2可以受MJ(Methyl jasmonate)和YE(Yeast extract)明显诱导Sm ERF2在YE诱导2h时表达最高,在MJ诱导1h时表达最高;而Sm O3L3诱导显得比较缓慢,在MJ和YE诱导12h时均可以达到两倍。3.瞬时转化烟草分析Sm ERF2和Sm O3L3的亚细胞定位表明Sm ERF2和Sm O3L3均定位于细胞核中,这与它们作为转录因子的特点是相符合的。4.过表达Sm ERF2毛状根中,MEP途径的Sm DXR和Sm DXS2,MVA途径的Sm HMGS和下游的Sm KSL均有不同程度的表达上调,丹酚酸合成的一个支路途径的基因Sm HPPD表达上调;过表达Sm O3L3毛状根中丹酚酸合成相关的Sm4CL1,Sm RAS表达上调。在Sm ERF2-RNAi和Sm O3L3-RNAi毛状根株系中丹参酮和丹酚酸合成相关基因的表达呈现出和对应过表达株系的相反变化。5.过表达Sm ERF2的丹参毛状根中丹参酮含量明显上调,平均可达6.488mg/g(干重),是对照1.58倍,其中最高株系可达9.2 mg/g,是对照2.21倍,这与Sm ERF2响应YE诱导相一致(YE可明显诱导丹参酮合成),说明Sm ERF2在调控丹参酮合成中有重要作用;过表达Sm O3L3的丹参毛状根中丹酚酸含量明显上调,平均可达49 mg/g(干重),是对照的1.43倍,其中最高株系可达63.7 mg/g,是对照1.86倍,说明Sm O3L3在调控丹酚酸的合成有重要作用。6.酵母单杂结果表明,丹参中Sm ERF2和Sm O3L3只可以和GCC-box结合,而且初步判断Sm ERF2和Sm O3L3可以与(A/G/C)GCCGCC结合,而不能与TGCCGCC结合。7.此外,本研究还将Sm ERF2和Sm O3L3转化到模式植物拟南芥中,研究它们在响应病原菌侵染以及各种逆境中可能的调控作用。综上所述:本研究克隆了Sm ERF2和Sm O3L3两个丹参的ERF类转录因子,它们均受MJ和YE的诱导,其中Sm ERF2在调控丹参酮合成中有重要作用,而Sm O3L3在调控丹酚酸的合成有重要作用,为改善丹参的种质资源提供了一定的理论基础。