近年来相关研究表明端粒长度与人类衰老以及肿瘤等疾病的发生有关，成为研究热点。端粒长度可以作为肿瘤标志物和衰老相关疾病的标记，但目前将其应用于疾病的预防还存在较多困难。其中一个重要的不确定因素来自端粒长度的检测技术的局限，现有端粒长度检测技术相对复杂，各有所短，无标准化的操作步骤，致使不同实验室检测结果不一，甚至同一实验室不同批次检测结果不一，检测结果难以进行横向比较。因此，十分有必要建立一种更加快速高效的方法检测端粒长度。
　　支原体污染在实验室屡见不鲜,据调查及研究显示,实验室30%-60%细胞都被支原体污染过。细胞基质的支原体污染将导致受污细胞生物学特性发生巨大变化，对科研结果及生物制品的制造和安全产生严重影响。常见的支原体检测方法有分离培养法、电镜观察法、DNA荧光染色法、酶联免疫吸附试验法和PCR方法等，但这些方法均存在一定的局限性，因此本研究建立一种快速、高效的方法检测支原体，这不仅可以有效地减少和预防支原体污染，对后续的研究也具有一定指导意义。
　　实时荧光定量PCR技术因其具有操作简单、快速、实时性且灵敏度高，特异性强，能完成多重反应的优势，可以实现同时对参考基因及目的基因的检测，提高基因检测的准确度，在分子诊断领域运用广泛。
　　本论文由两部分工作构成：1建立多重荧光定量PCR检测端粒长度方案。2.建立多重荧光定量PCR检测支原体方案及应用。
　　第一部分：
　　本研究建立一种基于多重荧光定量PCR的更为简单方便快速的端粒定量检测方案。参照OCallaghan等在2011年发表的TEL及36B4引物序列，及Myakishev等在2001年发表的universal ET-labeled primers（简称Uniprimer），依照引物、分子信标、TaqMan探针及Uniprimer设计原则，本研究设计并合成看家基因36B4引物，分子信标，Telomere（简称TEL）加尾延伸引物及分子信标、Uniprimer。通过优化退火温度、引物及分子信标浓度、Mg2+浓度、反应体系建立单重分子信标检测36B4及TEL方案，结果表明：36B4 Ct值为25左右，TEL Ct值为15左右。36B4标准曲线相关系数r2为0.955，扩增效率为124.217%；TEL标准曲线相关系数r2为0.986，扩增效率为112.908%。相关性较好，扩增效率较高，可实现端粒长度检测。利用SYBR Green染料检测TEL， Uniprimer探针检测看家基因36B4，通过优化退火温度、引物及Uniprimer浓度，建立端粒长度多重荧光定量PCR检测方案。结果表明：36B4标准曲线相关系数r2为0.99，扩增效率为105.237%;TEL标准曲线相关系数r2为0.991，扩增效率为116.427%，相关性较好，扩增效率较高；固定36B4浓度，TEL浓度加倍后，结果显示36B4 Ct值较稳定，TEL浓度相差两倍约差1个Ct值，且比较单重与双重结果，双重检测-△Ct值均小于单重的。构建易于稳定扩增和保存的基于质粒标准品及大肠杆菌基因组标准品，实现不同批次检测的数据比较。
　　利用该方法随机选择血液抽提基因组样本，分别以混合样本作为标准品及标准大肠杆菌基因组标准品检测端粒长度，两者检测结果较一致。进一步优化该方案后，以混合样本作为标准品用于检测60例血液抽提基因组样本的端粒相对长度，重复性验证实验显示检测结果较稳定。
　　综上所述，本研究构建了多重荧光定量PCR端粒长度检测方案，可以有效消除孔间差，提高检测的准确度及稳定性，且操作简单，快速。提供对照标准品可以在不同批次之间使用，实现不同批次之间结果的有效对比。
　　第二部分：
　　利用多重荧光定量PCR（TaqMan探针法）检测支原体，反应体系中同时存在标记两种荧光标记的TaqMan探针及相关引物，其中报告荧光基团FAM检测支原体，报告荧光基团VIC检测参考基因。根据支原体16S核糖体RNA和参考基因TOP3A保守区设计引物和探针。通过对引物与探针浓度、退火温度等反应条件的优化，建立了基于TaqMan探针的多重荧光定量PCR检测方法，进一步对该方法的灵敏度和重复性进行了验证。结果显示：标准曲线相关系数r2和扩增效率分别为0.995和113.36%；灵敏度为10 copies；组内及组间变异系数均小于1%，证明该检测方法高效。利用该方法对随机挑选279例细胞抽提DNA样本进行检测，结果有126例为支原体阳性样本，阳性率45%。检测3例细胞培养上清样本，结果1例支原体阳性，2例支原体阴性。从检测的样本中随机选择3个阳性样本及2个阴性样本使用普通PCR支原体检测试剂盒检测，结果一致；将其测序，测序结果比对正确。
　　综上表明本研究建立的多重荧光定量PCR支原体检测方法能够应用于细胞抽提DNA及细胞培养上清的支原体检测，该方案操作简单、高效。