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背景Fractalkine(FKN)是一具有粘附活性的趋化因子。膜结合型FKN独特的粘蛋白样杆状结构凸出细胞膜表面,使其易粘附流动的白细胞。并且,FKN介导的粘附反应不需要选择素(selectin)和整合素(integrin)等其他黏附分子的参与。FKN蛋白跨膜区N端有一段特殊的保守部位,即由Thr-Arg-Arg-Gln组成的二元断裂位点(dibasiccleavage site),在此断裂位点被蛋白水解酶水解脱落,形成可溶FKN,发挥趋化效应。FKN独特的结构和功能使其广泛参与炎症反应。慢性炎症反应是动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的重要重要机制之一,白细胞越过血管向炎症部位移行是炎症反应中重要的生物学现象。单核细胞是AS中泡沫细胞的前体细胞,在向炎症部位迁移的过程中需要趋化因子和黏附分子的参与。近年来的研究资料表明,FKN参与了AS的发生发展。白细胞介素—18(Interleukin-18,IL-18)是重要的炎症因子,是动脉粥样硬化明确的危险因素。其在冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生、发展及粥样斑块破裂等过程中发挥重要作用。以往的研究多认为,IL-18与AS的密切关系主要是通过干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)实现的。而且,在IFN-γ缺失的情况下,IL-18的相关功能则无法体现。但近期的研究表明,在没有IFN-γ的参与下,IL-18也可以参与AS的炎症过程。IL-18与IL-18R结合导致多种与动脉粥样硬化相关的细胞因子如IL-6、IL-8、细胞黏附分子-1和多种基质金属蛋白酶(MMPs)分泌增加。然而,IL-18能否诱导和上调FKN的表达,并通过FKN的趋化和粘附功能参与炎症反应,及其机制尚不清楚。辛伐他汀(Simvastatine,Sim)是由土曲霉菌降解产物合成的三羟基三甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂,广泛用于冠心病的预防和治疗。除降脂外,还具有改善内皮功能,改善心肌缺血,抗炎、抗血栓,稳定动脉粥样硬化斑块等作用。Sim能否通过影响FKN的表达而发挥抗炎、稳定斑块的作用尚不明确。目的(1)应用IL-18作为刺激因素,探讨IL-18能否诱导脐静脉内皮细胞(HUVEC)上调表达FKN,明确两者的作用关系及信号通路;(2)应用Transwell进行体外趋化试验,观察FKN对巨噬细胞源性单核细胞株(THP-1)的趋化作用;(3)应用Flow chamber模拟人体生理血流环境,观察FKN介导的HUVECs和THP-1细胞的粘附;(4)探讨辛伐他汀对FKN表达的影响,以及对FKN趋化和粘附作用的干预效应。方法(1)HUVECs与100 ug/L的IL-18孵育0、1、6、12、24小时,半定量RT-PCR方法检测FKN的mRNA表达;(2)HUVECs分别与浓度为0ug/L、25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18共孵育24小时,半定量RT-PCR方法检测FKN的mRNA表达;(3)预先用10umol/L、30umol/L的PDTC预处理HUVECs,再用100ug/L的IL-18刺激24小时,半定量RT-PCR方法检测FKN的mRNA表达;(4)预先用1umol/ml、10umol/ml、100umol/ml的辛伐他汀预处理HUVECs,再用100ng/L的IL-18刺激24小时,半定量RT-PCR方法检测细胞FKN的mRNA表达;(5)HUVECs与0ug/L、25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18孵育24小时;10umol/L、30umol/L的PDTC预处理HUVECs,再用100ug/L的IL-18刺激24小时;预先用10umol/ml、100umol/ml的辛伐他汀预处理HUVECs,再用100ng/L的IL-18刺激24小时;100 ug/L的IL-18刺激HUVECs 24小时后,用1umg/L、5ug/L的FKN中和抗体作用3小时。应用Transwell装置观察FKN对THP-1细胞的趋化效应;(6)HUVECs与0ug/L、25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18孵育24小时;10umol/L、30umol/L的PDTC预处理HUVECs,再用100ug/L的IL-18刺激24小时;预先用10umol/ml、100umol/ml的辛伐他汀预处理HUVECs,再用100ng/L的IL-18刺激24小时;100 ug/L的IL-18刺激HUVECs 24小时后,用1umg/L、5ug/L的FKN中和抗体作用3小时。应用Flow chamber装置观察FKN在模拟生理血流环境下介导的HUVEC与THP-1细胞的粘附。结果(1)HUVECs与100ug/L的IL-18孵育1小时后,FKN表达无明显增加,与空白对照组相比p＞0.05;HUVECs与100ug/L的IL-18孵育6、12、24小时后,FKN的基因表达明显增加,与空白对照组比较p＜0.01;(2)HUVECs与5ug/L的IL-18孵育24小时后,FKN表达量无明显增加,与空白对照组相比p＞0.05;HUVECs与25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18孵育24小时后,FKN的基因表达明显增加,与空白对照组比较p＜0.01;(3)用10umol/L、30umol/L的PDTC预处理HUVEC后,再加入100ug/L的IL-18孵育24小时,FKN表达量明显减少,与未经PDTC处理的单纯100ug/L IL-18刺激组比较p＜0.01;(4)用1 umol/L的辛伐他汀预处理HUVECs后,再加入100ug/L的IL-18孵育24小时,FKN表达量无明显变化,与单纯100ug/L IL-18刺激组比较p＞0.05;用10umol/L、100umol/L辛伐他汀预处理HUVEC后,再加入100ug/L的IL-18孵育24小时,FKN表达量明显减少,与未经辛伐他汀处理的单纯100ug/L IL-18刺激组比较p＜0.01。(5)成功使用Tranwell装置进行了体外趋化试验;FKN能够趋化静息的THP-1细胞;(6)不同浓度IL-18上调FKN表达后,对THP-1细胞的趋化效应明显增强,与对照组比较p＜0.01;PDTC、辛伐他汀预处理HUVEC后,该趋化效应明显减弱,与单纯IL-18刺激组相比p＜0.01;FKN中和抗体能够抑制FKN介导的趋化作用,与单纯IL-18刺激组相比p＜0.01。(7)成功应用Flow chamber在体外模拟了人体生理状态的血液循环条件进行粘附实验;使用EDTA阻断其他黏附分子的参与后,FKN以非钙离子依赖的方式介导了HUVECs与单核细胞THP-1的粘附;(8)不同浓度IL-18上调FKN表达后,THP-1细胞与HUVEC的粘附明显增加,与对照组比较p＜0.01;PDTC预处理HUVEC后,该粘附效应明显减弱,与单纯IL-18刺激组相比p＜0.01。FKN中和抗体能够抑制FKN介导的粘附作用,与单纯IL-18刺激组相比p＜0.01。10umol/ml的辛伐他汀预处理HUVEC后,未能明显抑制FKN介导的粘附反应,与单纯IL-18刺激组相比p＞0.05。100umol/ml的辛伐他汀能够明显抑制该粘附效应,与单纯IL-18刺激组相比p＜0.01。结论(1)IL-18能够呈浓度、时间依赖性上调FKN的基因表达。这种诱导作用与NF-KB信号转导途径有关;(2)FKN能够趋化静息THP-1细胞,IL-18能够增加THP-1细胞的迁移;(3)在模拟生理血液循环的条件下,FKN能够介导HUVECs与静息THP-1细胞的粘附,IL-18能够增强该粘附反应;(4)辛伐他汀能够抑制IL-18诱导HUVECs上调表达FKNmRNA,抑制FKN介导的趋化及粘附作用。