冬凌草系唇形科香茶菜属植物,其主要抗肿瘤活性成分为二萜类化合物,如冬凌草甲素、冬凌草乙素、柔茎香茶菜甲素等。大量研究表明,上述二萜类化合物对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用,且这些作用涉及细胞周期阻滞、细胞凋亡、细胞自噬、癌蛋白调节、ROS聚集、MAPKs和PI3K/Akt信号通路调节及Micro RNAs正常表达改变等。但本类化合物的抗肿瘤作用机制非常复杂,目前尚未完全明确。课题组前期设计合成了柔茎香茶菜甲素14-氨基酸酯衍生物,本论文在此基础上开展系列衍生物的抗肿瘤活性测试、代谢组学分析,并进一步探索本类化合物的抗肿瘤分子作用机制。具体内容如下:1.目标化合物的选择:以先导化合物DOPT及其14位氨基酸酯衍生物DOPT-003、DOPT-010和DOPT-043为目标化合物,以冬凌草甲素为阳性对照物。采用MTT法进行体外抗肿瘤活性筛选:MTT法72 h抗增殖活性检测结果表明:化合物活性DOPT-043>DOPT-003>DOPT-010>冬凌草甲素;四种化合物对Eca-109和MGC-803作用均较好,尤其以对Eca-109的抑制活性最佳。进行了DOPT和DOPT-043的24 h、48 h和72 h抗增殖活性检测,发现它们的抗增殖作用随着作用时间的延长和化合物浓度增高而增强。2.代谢组学研究:以目标化合物分别刺激相关肿瘤细胞系,采用非靶标代谢组方法,筛选差异代谢物,富集代谢途径,分析其可能的作用机制。非靶标代谢组的差异代谢物筛选标准为FC>1.5或FC<0.67、p<0.05和VIP>1,得到了3组差异代谢物,共同特点是代谢物含量相对上升的主要为脂肪酸类和多胺类,含量相对下降的主要为氨基酸类与有机酸类等,主要影响的代谢途径氨基酸代谢和鞘脂代谢。3.作用机制研究:细胞集落形成实验表明,DOPT-043能够抑制Eca-109集落的形成,并且抑制作用随着DOPT-043浓度的增加而增加;细胞划痕实验表明,Eca-109的迁移能力随着DOPT-043浓度的增加而显著减弱;流式细胞术实验表明,DOPT-043对Eca-109的细胞凋亡作用和胞内ROS水平均随着浓度的增加而增加,但是对其细胞周期阻滞作用影响并不明显;WB结果显示促凋亡蛋白Bax、Bid、Cyto-C、Cleaved-Caspase 3、Cleaved-Caspase 7、Cleaved-Caspase 9、Cleaved-PARP的表达均上调,Bcl-2表达下调;上皮标志蛋白E-cadherin的表达上升而间质标志蛋白N-cadherin、MMP2和Vimentin的表达下降;精胺氧化酶SMOX表达上调。综上所述,我们发现:柔茎香茶菜甲素14-氨基酸酯衍生物具有良好的体外抗肿瘤活性,其中DOPT-043活性最佳,本系列化合物对Eca-109具有一定的选择性。DOPT-043对Eca-109的抑制作用具有时间浓度依赖性,可以明显促进癌细胞凋亡,抑制癌细胞迁移。DOPT-043可能的抗肿瘤作用机制是:通过抑制三羧酸循环供能,激活脂肪酸氧化代谢补偿供能以及增强氨基酸代谢导致精胺与亚精胺间转化增多,进而产生了大量活性氧(ROS)。ROS可进一步造成细胞DNA损伤,促使p53表达上调;可上调促凋亡蛋白Bax、Bid,下调抑凋亡蛋白Bcl-2,促进Cyto C释放,激活酶原Caspase 9,进而活化酶原Caspase3和Caspase 7,启动Caspase级联反应进一步剪切PRAP,引发细胞凋亡,从而发挥抗增殖作用。