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弓形虫是呈世界范围传播的胞内寄生性原虫,能感染包括人类在内的几乎所有的温血动物,其引起的弓形虫病在免疫缺陷、抑制个体中是致命性的,目前还无有效的治疗药物,因此研发安全且切实有效的疫苗一直是该病防治的关键。近年发现的弓形虫免疫作图蛋白1(Immune mapped protein1,IMP1)定位于虫体表膜且具有较强的免疫原性,可作为疫苗候选分子,本研究通过同源重组基因敲除、间接免疫荧光、免疫印迹等技术对imp1基因功能进行研究,探讨imp1基因与弓形虫脑内增殖及与细胞自噬的作用,为弓形虫病防控奠定理论基础。1.弓形虫imp1基因敲除载体及回补载体的构建为研究弓形虫imp1基因的功能,本研究拟通过构建同源重组敲除质粒及回补质粒,筛选基因敲除及回补虫株。以弓形虫△ku80 RH株基因组DNA及cDNA为模板,设计特异性引物,PCR扩增imp1 5’ UTR、imp1 3’ UTR、imp1CDS及sag1启动子区,其中imp1 CDS和sag1启动子序列通过融合PCR进行连接。以pBSK(+)质粒为骨架,利用限制性内切酶插入imp1 5’ UTR、imp1 3’ UTR和ble药物基因,构建成基因敲除质粒pBSK-imp1 5’UTR-ble-imp1 3’UTR;此外,以pTCY质粒为骨架,利用限制性内切酶插入imp 5’ UTR、imp1 3’ UTR 和 Psag1-imp1 CDS 序列,构建成回补质粒 pTCY-imp1 5’UTR-CAT-Psag1-imp1 CDS-imp1 3’ UTR。结果表明通过分子生物学技术成功构建了imp1基因敲除质粒和回补质粒。2.弓形虫imp1基因缺失株及回补株的筛选、鉴定及生物学功能研究通过同源重组的方法,将弓形虫imp1基因进行替换并经过药物筛选获得基因缺失株,并在基因缺失株基础上筛选回补株,并通过PCR、western blot和间接免疫荧光等技术对缺失株及回补株进行鉴定;将野生型、缺失株及回补株三种虫株感染Vero细胞,并在不同时间点收集样品,通过激光共聚焦显微镜对三种虫株的黏附、入侵速殖子数目进行计数分析,同时对这三者的胞内增殖通过绝对荧光定量PCR技术进行分析;另外,将三种虫株接种ICR小鼠,通过记录各组小鼠的存活情况及对各组小鼠的肺、肝、脾组织中的虫荷数进行分析。结果表明缺失株在黏附试验的各时间点(15 min、30 min、45 min、1h、2h、4h)统计到的速殖子个数均显著少于野生型及回补虫株,与野生型相比分别降低了 70.6%、68.0%、60.0%、53.6%、53.2%和 48.7%,入侵试验中(45 min、1 h、2 h、4h)缺失株的速殖子个数也分别降低了 58.2%、51.1%和46.3%,而胞内增殖(24h、48 h、72 h)也分别降低了 70.7%、65.0%和47.0%;体内实验中,接种野生型及回补虫株的小鼠都在感染后9天内死亡,而接种缺失株的小鼠平均存活时间为26.8±2.6天,显著高于野生型及回补虫株,在肺、肝、脾组织检测到的虫荷数也显著低于野生型及回补虫株接种的小鼠。3.弓形虫感染引起细胞自噬为探索弓形虫胞内增殖与细胞自噬的关系,将弓形虫感染Vero细胞,通过透射电子显微镜、激光共聚焦、免疫印迹、绝对荧光定量PCR等技术手段,证明了弓形虫感染能诱导细胞发生自噬,结果表明,弓形虫感染诱导细胞自噬小体的形成并且观察到少量的自噬溶酶体,间接免疫荧光也观察到细胞内LC3聚集在弓形虫的周围,LC3与溶酶体也存在一定比例的共定位现象,免疫印迹结果则证实了弓形虫感染细胞后LC3-Ⅱ比例的显著增加,说明弓形虫诱导细胞发生了自噬。对细胞分别使用自噬抑制剂3-MA和促进剂雷帕霉素处理后检测弓形虫的胞内增殖,结果发现细胞自噬抑制组对弓形虫胞内增殖水平显著性地低于自噬促进组,说明细胞自噬的状态与弓形虫的胞内增殖水平密切相关。研究结果为进一步探索弓形虫感染过程中细胞自噬对弓形虫的增殖及致病作用的影响奠定了基础。4.弓形虫感染引起细胞自噬的信号通路为探究弓形虫感染诱导细胞发生自噬的信号通路,本研究通过免疫印迹检测了诱导自噬的几条经典通路中多种组分的蛋白及其磷酸化水平,结果发现Raf1-MEK-ERK通路中的Raf1和ERK1/2蛋白及其磷酸化水平均显著高于对照组,相对荧光定量结果也表明了 Raf1、MEK、ERK1/2的RNA水平也显著高于对照组;对细胞分别使用ERK1/2抑制剂FR180204、Raf1抑制剂sorafenib、MEK抑制剂UO126-EtoH进行预处理再感染弓形虫进行蛋白分析,结果表明各抑制剂处理后相应地蛋白表达均发生了不同程度的下降但都显著低于无处理对照组,而移除抑制剂并接种弓形虫后检测到Raf1-MEK-ERK通路的各组分蛋白均得到了不同程度的回升。对各抑制剂组的弓形虫胞内增殖进行绝对银光定量分析,结果表明除MEK抑制剂UO126-EtoH处理组外,其余均显著低于对照组;而对弓形虫imp1、rop18、gra7增殖相关基因的mRNA水平分析,结果表明,各抑制剂组中imp1、rop18的mRNA水平有不同程度的下降,而gra7有一定程度的上升,以上结果表明弓形虫感染诱导细胞发生自噬是通过Raf1-MEK-ERK通路进行信号转导,并且对该通路进行抑制后弓形虫的胞内增殖水平有所降低,增殖相关基因mRNA水平也有一定的降低。5.弓形虫IMP1蛋白与细胞自噬的互作弓形虫IMP1蛋白具有很强的免疫原性,IMP1亚单位疫苗能提供较好的抗弓形虫保护力。为研究IMP1蛋白与细胞自噬的关系,构建了 pcDNA-pSAG1-IMP1真核表达载体并将之转染进Vero细胞,通过免疫印迹检测IMP1的表达确认转染成功,随后对检测自噬相关通路的蛋白及磷酸化水平,初步确认IMP1蛋白通过Raf1-MEK-ERK和AMPK-TSC2-mTOR通路诱导细胞自噬;通过免疫共沉淀技术,确认IMP1与Raf1-MEK-ERK通路的是间接互作。该发现为进一步研究弓形虫与Raf1-MEK-ERK通路的互作奠定了一定的基础。综上,通过基因工程技术获得了弓形虫△ku80 △imp1 RH虫株,对缺失株进行生物学特性研究,发现缺失imp1基因后弓形虫的粘附、入侵和胞内增殖能力显著降低,体内攻毒试验也发现缺失株对小鼠的毒力也显著降低。弓形虫感染引起了 LC3蛋白的聚集,及比例较小的自噬溶酶体,通过Raf1-MEK-ERK信号通路诱导细胞发生了不完整的自噬,且自噬水平与弓形虫胞内增殖水平正相关。