血脑屏障(BBB)是位于血液和中枢神经系统(CNS)之间的一个动态而复杂的屏障结构。血脑屏障表达有其特有的跨膜转运系统,以调节各种物质进出脑实质。血脑屏障由一层紧密连接没有开口的脑微血管内皮细胞构成,并含有低水平的吞饮小泡以及由紧密连接和粘附连接组成的连接复合体。作为保护脑实质的重要屏障,维护BBB的结构及功能正常极其重要。葡萄糖是脑部最重要的养分,脑组织不能生产也无法储存葡萄糖,必须依赖血液中的葡萄糖不断地供应,人体每天产生的葡萄糖至少有一半是提供脑部使用。低血糖症指的是由血糖含量过低引发的临床医疗症状。来自于临床的资料显示,即使是血糖持续低下单一因素,也足以引起大脑功能障碍。当血糖太低时,脑部缺乏葡萄糖,将使大脑代谢受到严重影响,轻则反应迟钝,重则昏迷甚至神经细胞死亡。实际上,血糖过低会破坏脑血管内皮细胞屏障功能,导致罹患脑血管疾病风险增加。目前尚无彻底消除由低血糖引发的内皮细胞连接破坏和神经血管损伤的调控手段,因此十分有必要探究并阐释由低血糖介导的血脑屏障损伤机制。自噬是一个机体内自发的降解机制,包括细胞质成分的溶酶体降解等过程,为细胞的重要生命活动提供能量和关键成分。在人类的血管内皮细胞中,自噬在正常生理状态下主要发挥清除代谢产物,改善细胞存活环境的功能。但是在内皮细胞受到持续应激源影响时,包括脑缺血、葡萄糖剥夺、缺氧和活性氮成分等,则自噬可能被过度诱发而出现对细胞的消极影响。大量证据证明自噬和细胞凋亡也许在时间先后上存在一定的关联,自噬的反常可能导致细胞功能失调,甚至促进血管内皮细胞死亡。LC3(microtubule-associated protein 1 light chain 3)是细胞内重要的自噬标志物,细胞质内LC3-Ⅰ可能脂化反应为LC3-Ⅱ的形式,而LC3-Ⅱ被认为是内皮细胞启动自噬反应的指示器。尽管有证据证明自噬在神经退行性疾病过程中出现上调,但是我们对低血糖应激下大脑内皮细胞内的自噬作用的增强或抑制的变化规律还不清楚,对其相关作用的理解还是知之甚少。过氧亚硝基阴离子(ONOO-)属于活性氮物种之一,由机体内一氧化氮(NO)和超氧阴离子(O2-)反应产生。ONOO-通过使蛋白质发生酪氨酸硝化和过氧化物酶泛素化以抑制前列环素合酶活性。我们前期也发现硝化应激在缺血性脑损伤过程中可以调控自噬过程。大量证据显示脑血管内皮细胞是硝化应激在神经退行性疾病及其并发症过程中的主要作用靶细胞。尽管我们了解到在神经血管的损伤和血脑屏障破坏的病理过程中,由硝化应激引发的促进自噬过程和蛋白质破坏是重要环节,但是其作用机制尚不清楚。TIGAR(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator)存在磷酸激酶 2 活性,通过促进磷酸戊糖途径来水解细胞水平的果糖-2,6-二磷酸(fructose-2,6-bisphosphate)和果糖-1,6-二磷酸(fructose-1,6-bisphosphate),达到抑制糖酵解作用的目的。同时,TIGAR可以激活线粒体呼吸链反应,调节细胞在缺氧条件下的氧化还原代谢作用,促进细胞生存。近期研究表明TIGAR对脑缺血损伤显示出一定的保护作用,主要是通过增加细胞NADPH水平和促进抗氧化活性以限制氧化应激介导的细胞凋亡和线粒体自噬过程。然而,TIGAR在低血糖应激下调节脑内皮细胞紧密连接的破坏过程发挥保护作用和其潜在的机制仍然不清楚。我们目前的研究工作目标是阐明由代谢应激介导的脑血管内皮细胞紧密连接损伤的分子机制,研究重点之一则是解析TIGAR在自噬和大脑内皮细胞损伤过程之间所扮演的角色。在本实验中,我们深入研究了 TIGAR在脑血管内皮细胞中低血糖应激发生时的作用。我们发现,在低血糖状况下,TIGAR扮演的是敏感生物传感器的角色。利用蛋白免疫印迹分析,我们对无糖培养基另加葡萄糖的条件下24小时培养的脑血管内皮细胞进行分析,可观察到TIGAR表达量伴随葡萄糖浓度增高而增高。此外,在低糖条件下细胞内TIGAR表达量随着时间延长而增强,但在24小时后较正常对照组相比出现下降。在培养的脑血管内皮细胞中,紧密连接蛋白质如Claudin-5和occludin的表达量是反映脑屏障通透性的关键因素。我们通过在免疫细胞化学实验使用抗TIGAR抗体观察到了 TIGAR的亚细胞定位。在内皮细胞转染编码Claudin-5的GFP慢病毒载体(GFP-Claudin-5)后,我们在大脑内皮细胞紧密连接处观察到了强GFP荧光。免疫组化图像分析显示了在内皮细胞中TIGAR和Claudin-5存在共定位。同时,在低血糖应激下,我们观察到occludin和JAM-A蛋白出现时间和浓度依赖性的分解片段增加,伴有JNK磷酸化作用增强及基质金属蛋白酶(MMP-9)的上调。在对照条件下,显示TIGAR在大脑内皮紧密连接的亚细胞定位,然而在低血糖损伤24小时后,TIGAR表达量大量减少且紧密连接也失去了完整性。此后,我们又诠释了 TIGAR在低糖条件诱导的大脑内皮细胞损伤中的潜在作用。人类脑血管内皮细胞在24小时低血糖条件刺激后再分别转染空载体,重组人类TAT-TIGAR和慢病毒-GFP-TIGAR,结果显示TIGAR过表达可以抑制occludin和JAM-A的降解。值得一提的是,在低血糖条件下给予3-PO处理条件下,我们观察到了 JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化的浓度依赖性增高和脑血管内皮细胞紧密连接蛋白的进一步降解。由此提示,TIGAR在低糖代谢应激条件下对脑血管内皮细胞起保护作用。进一步,我们采用形态学技术评估了 TIGAR对由低血糖引发的紧密连接损伤的保护作用。免疫细胞化学分析显示了 occludin在大脑血管内皮细胞中的亚细胞定位。在低血糖刺激下,occludin在细胞质膜呈现弥散性分布。TIGAR的过表达抑制occludin降解并保护内皮细胞紧密连接处的完整性。我们之后用电子显微镜显示了内皮细胞紧密连接处的超微结构。在正常对照情况下,内皮细胞紧密连接通常出现在细胞与细胞相接触的区域,然而这种紧密连接结构会随着低血糖应激增强而被破坏。然而,在细胞培养中LV-TIGAR的过表达则可抑制细胞间紧密连接蛋白结构的异常破坏。这些结果表明了 TIGAR可以减轻低糖应激条件下紧密连接的损害。由此我们提出以下问题,TIGAR是经由何种机制起到保护脑血管内皮细胞的作用呢?在这中间自噬环节是否参与?在低糖培养条件下,LC3-Ⅰ到LC3-Ⅱ间的转化作用随着所给葡萄糖浓度的降低而增高。并且,在低血糖应激24 h处理条件下,我们同样观察到了 LC3-Ⅱ的含量随着时间增长而增高的现象,表明了自噬过程的活化。这些结果表明低血糖应激扰乱了大脑内皮细胞内的自噬过程调节。为了标记及追踪LC3以及自噬流的变化,我们又用稳定表达红绿双荧光蛋白-LC3的质粒(mRFP-GFP-LC3)进行转染,确证了脑血管内皮细胞中的自噬过程在低糖应激条件下被诱发。我们发现在24小时处理过程中,低血糖应激下自噬随着时间依赖性增强,主要表现为LC3-Ⅱ水平的持续升高。自噬体与溶酶体融合的抑制剂氯喹能够促进细胞内mRFP-LC3和GFP-LC3斑点的形成,提示自噬流被阻断,自噬体的生成增加,与溶酶体的融合也增加。这些结果提示自噬参与到低糖应激导致的脑血管内皮细胞损伤病理过程中。我们又进一步采用Bafilomycin a1验证了在低血糖应激下自噬抑制剂在脑血管内皮细胞的作用,以此来探讨自噬和血管内皮细胞紧密连接蛋白损伤之间的关系。药物BafilomycinA1是溶酶体膜上H+-ATPase阻断剂,可有效升高溶酶体腔内pH,扰乱自噬空泡与溶酶体的融合。在缺乏BafilomycinA1的情况下,对照组细胞LC3-Ⅱ的表达量随着时间没有出现变化;但是当使用了BafilomycinA1后,LC3-Ⅱ的水平在6-24小时内明显增加,表明自噬流的确存在。在没有Bafilomycin A1的情况下,在低血糖应激下的12 h和24 h间LC3-Ⅱ出现增加,在6,12,24小时的节点我们记录到了 Bafilomycin A1存在条件下LC3-Ⅱ随着时间进一步增加。同时,在Bafilomycin A1处理后,降解的occludin蛋白含量与单独低糖处理相比出现进一步上调。有趣的是,在低糖条件下给PFKFB3抑制剂3-PO处理后,诱发LC3-Ⅱ的积累量进一步增加,伴有被降解的occludin和ZO-1含量同样出现显著增长。而在BafilomycinAl和3-PO共同处理时,在6,12,24 h又进一步增加了 3-PO导致的LC3-Ⅱ水平增加,被降解的occludin和ZO-1含量同样出现进一步增长。转染Atg5siRNA可显著减少LC3-Ⅱ的表达量,同时在低糖应激24小时条件下大脑内皮细胞内的occludin的降解以及JNK的磷酸化作用也随之降低,说明自噬在应激损伤后期介导了脑血管内皮细胞的损伤。进一步,我们也发现转导重组人类TAT-TIGAR可以抑制在低血糖应激下大脑内皮细胞内LC3-Ⅱ的积累量。为进一步验证实验结果,GFP标记的TIGAR质粒转染细胞后给予24小时低血糖应激条件,可观察到JNK的磷酸化作用和LC3-Ⅱ的含量大大减少。在低血糖应激条件下,LC3-Ⅱ的表达量增加,且增加程度在经3-PO处理后被显著放大。免疫细胞化学分析发现在低血糖应激下内皮细胞中mRFP-GFP-LC3囊泡的积累量增加,且在低血糖应激后再给3-PO(20μM)处理可观察到mRFP-GFP-LC3斑点形成增加。我们利用透射式电子显微镜观察由低血糖诱发的自噬体的形成,成功观察到了在低血糖应激下内皮细胞中的自噬泡特征,而TIGAR过表现则可明显抑制自噬泡的形成。综上所述,以上实验结果证明了低血糖应激引发的过度自噬对紧密连接可以造成损伤作用,TIGAR通过抑制脑血管内皮细胞过度自噬/自噬流紊乱,减弱了低糖应激导致的脑血管内皮细胞紧密连接蛋白损伤。既然内源性TIGAR起着抑制自噬,保护脑血管内皮细胞的作用,是何种因素导致它功能减弱的呢?我们进一步探究了硝化应激是否与大脑内皮细胞暴露于低糖应激下导致的TIGAR的功能障碍相关。根据蛋白质免疫印记分析和免疫荧光分析法结果,在脑血管内皮细胞中,在低血糖刺激后相当短的一段时间内(20-60min)便观察到硝基酪氨酸的水平显著增高,表明低糖应激后短时间内即可触发细胞硝化应激。我们接着又验证了低血糖应激引发的硝化应激和自噬作用之间的相互关系。ONOO-供体SIN-1(3-morpholinosydnonimine)则可刺激大脑内皮细胞内荧光斑点的形成并导致自噬体的形成,而ONOO-抑制剂尿酸则可显著减少mRFP-GFP-LC3斑点的形成。由此,硝化应激诱导的自噬过度增加可能是导致脑血管内皮细胞紧密连接蛋白损伤的重要原因之一。为了研究紧密连接外膜上在自噬过程中与TIGAR结合的分子物质,我们使用了质谱检测方法,其中检测出29种蛋白质具有高置信度,可能与自噬中结合TIGAR相关。进一步,我们采用免疫共沉淀技术确认了钙调素和TIGAR的相互作用关系。为了检测钙调蛋白结合至TIGAR上的实时动态变化,确认活细胞内两种蛋白质分子是否具有直接相互作用,我们进一步利用了荧光共振能量转移技术(FRET)。主要以分析检测CFP标志的钙调蛋白(CaM-CFP)和YFP标志的TIGAR蛋白(TIGAR-YFP)变化规律。我们观察在CFP荧光(受体)降低时,YFP荧光(供体)出现急剧上升。同样的,在HEK-293细胞中共表达CaM-CFP和TIGAR-YFP,24小时后可观察到由CFP(受体)荧光降低所造成的供体荧光的显著上升。另外,根据FRET技术和免疫沉淀TIGAR后再用HKⅡ抗体免疫印迹分析结果显示,我们发现HKⅡ和TIGAR间没有相关作用关系。进一步,我们发现在低血糖诱发的应激下,给予钙调素抑制剂(W7)处理后,LC3-Ⅱ表达量降低并同时伴有occludin和ZO-1降解减少。上述结果表明由低血糖应激诱发的TIGAR所调控的过度自噬作用可能与钙调蛋白存在一定的联系。基于硝化应激的发生依存于钙/钙调素的活性水平,我们推测低糖应激条件下硝化应激介导的TIGAR功能障碍可能与酪氨酸残基硝基化相关。低血糖应激引发的mRFP-GFP-LC3斑点形成可以被钙调素抑制剂W7(1μM)和ONOO-清除剂Melatonin(100nM)而减弱。进一步,我们根据质谱分析确认TIGAR蛋白的Y92位点很有可能是发生硝基化的酪氨酸残基位点。实验通过慢病毒介导TIGAR的过表达可以增加NADPH含量水平,保护occludin蛋白,而Y92A位点突变后的TIGAR不再能有效保护内皮紧密连接。在低血糖应激条件下TIGAR对自噬过程的调节作用进一步被证明是抑制了自噬体的形成,因为相对于在24小时低血糖应激下的内皮细胞模型内的荧光斑点,转染入突变的TIGAR反而更能增强mRFP-GFP-LC3荧光斑点。总的来说,我们的实验结果证明了 TIGAR在对抗低血糖应激诱导的损伤时通过保护内皮紧密连接的完整性和调节自噬过程来保护血脑屏障。而在这其中,由于其与钙调素结合的特点,使得TIGAR自身极易于成为ONOO-的损伤靶分子。因为ONOO-形成非常依赖于钙/钙调素,而快速形成的ONOO-局部高浓度微环境极易对周边蛋白质的酪氨酸残基造成损伤。最后,我们在胰岛素诱导低血糖的小鼠动物模型上同样验证了 TIGAR的保护作用。TIGAR过表达来对抗低血糖应激作用的效果可以用正电子发射断层扫描(positron emission tomography,PET)分析观察。在低血糖条件下野生型小鼠对FDG的摄取增强,而TIGAR转基因小鼠在低血糖条件下对FDG的标准摄取值则极为微量,这一现象表明了 TIGAR过表达在低血糖应激条件下可以通过磷酸戊糖途径代偿性改善脑内葡萄糖水平,以保护内皮紧密连接。更进一步,在低血糖诱导损伤的对照组动物相比,TIGAR转基因小鼠表现出的血管保护作用主要是通过抑制Claudin-5降解作用而达到维护微血管内皮细胞结构完整性而达到的。通过的电子显微镜检测也在小鼠脑皮层得到相似的结果,胰岛素诱导的低血糖应激的小鼠模型体内的脑微血管损伤可以被TIGAR基因过表达所逆转。本研究明确了低血糖应激条件下脑血管内皮细胞内硝化应激,调控自噬的TIGAR信号之间的相互关联作用。我们的实验结果解释了低血糖应激触发的TIGAR表达下调可以诱发内皮紧密连接的损伤作用,而TIGAR过表达则可以通过限制过度自噬保护内皮紧密连接的完整性。而低血糖应激条件可以触发硝化应激,通过TIGAR酪氨酸残基硝基化而导致TIGAR失活,最终导致脑血管内皮细胞保护作用丧失。我们的实验结果阐释了 TIGAR通过调控磷酸戊糖途径,增加NADPH产量,抑制过度自噬通路,最终表现对脑血管的保护作用。抑制硝化应激或提高TIGAR水平为脑血管疾病的预防和治疗药物研发提供了一种新的作用靶点和思路。