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骨科学权威著作《坎贝尔手术学》提出“膝关节是所有关节中最易受损伤的关节”,其中前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)是稳定膝关节的重要结构,在膝部各韧带损伤中最常见,其断裂几率高达70%以上。由于无法自行愈合, ACL断裂后通过手术方式进行重建已成为共识。常用自体移植物进行重建,其中应用最多的是骨-髌腱-骨(BPTB)及腘绳肌肌腱移植。但BPTB由于供区并发症的问题使用率开始下降,而自体腘绳肌肌腱重建ACL技术日趋成熟,因其供区病损小,对伸膝装置无干扰,可取得与采用BPTB重建类似的膝关节稳定效果,因而已成为目前的主流重建方式。但有临床报道,采用自体腘绳肌肌腱重建ACL后,术后可出现关节不稳,主要是由于腱-骨愈合不良所致。因此移植肌腱与骨隧道之间及早、可靠地愈合,即高质量的腱-骨愈合,是ACL重建手术成功的关键。而关于肌腱在骨隧道内愈合机制,至今未有确切表述,但学者研究发现,腱-骨愈合过程中,新生骨向肌腱方向长入的过程是主要的,而且腱-骨间生物力学功能的提高与新生骨长入的程度呈正相关。因此促进腱-骨间新生骨长入,成为促进腱-骨间生物愈合的有力措施。研究显示,腱-骨间骨生长的过程类似于骨折愈合的过程。从组织工程技术的角度考虑,骨隧道内原已存在的骨髓提供了多分化潜能细胞来源,选择具有明显诱导成骨效果的骨形态发生蛋白(BMP)作为生长因子可促进骨生长,然而选择什么样的支架作为BMP的适合载体至今未有定论,尤其在ACL重建过程中。因此,本实验通过探讨不同类型、不同特性的载体材料负载BMP应用于ACL重建中,通过组织学、生物力学及Micro-CT等影像学各方面的检测,试图寻找符合ACL重建应用要求且具有良好成骨效果的支架。本课题中我们首次比较了负载BMP的注射型与固态型载体在ACL重建中促进腱-骨愈合的不同作用,探讨了具有三维立体结构多孔隙的支架材料在ACL重建术中促进腱-骨愈合的效果。本课题主要从以下四个方面进行了具体研究。1、三种不同载体材料复合骨形态发生蛋白构建的复合生物材料特性的实验研究将牛BMP与三种具有良好生物相容性、临床常用但使用方法及物理特性不同的载体材料复合,比较复合后的三种生物材料之间的不同。注射型纤维蛋白胶(FG)及磷酸钙骨水泥(CPC)分别与BMP混合形成复合材料的初凝时间(IT)和终凝时间(FT)与单纯FG及CPC相比均无显著性差异。扫描电镜图像显示,FG由细小颗粒组成,结构平整,未见大孔隙出现。复合BMP后表面结构变得粗糙,有较为均一、但直径明显增大的BMP粉末黏着,之间有微孔结构;CPC则由不规则的扁平状、颗粒状和块状晶体组成,晶体间有不规则的孔隙,孔隙大小为2-20μm。与BMP复合后仍由上述形态的晶体构成,晶体上和孔隙间均匀地附着大量絮状BMP颗粒,晶体间孔径较单纯的CPC略大,约为5-50μm;牛松质骨(bCB)呈现规则孔隙结构,包含大孔(300-500μm直径)和小的交通孔(50-80μm直径),复合后的RBX可见棉絮状BMP物质充填在孔隙当中。材料生物力学结果证明,三种复合材料的最大抗压强度均略有降低,但与单纯材料组相比较,均无显著性差异。而小鼠肌袋实验结果表明,术后2周,三种复合材料组的ALP酶活性均较单纯bBMP组显著性增高,其中RBX组最高。组织学结果同样证明,三组复合材料组均比单纯BMP组成骨效果明显。以上结果证明,三种材料复合BMP后,都增强了BMP诱导成骨作用,而材料自身的特性并未因BMP的载入而受到负面影响。这些实验结果为我们下一步进行复合材料细胞相容性相关研究奠定了基础。2、兔骨髓基质干细胞在复合骨形态发生蛋白的三种载体材料上增殖和分化的对比研究将兔骨髓基质干细胞(BMSC)接种在三种复合材料上,观察它们对BMSC增殖和分化的影响。MTT测试结果显示,RBX组和CPC复合组在整个实验期内,与空白对照组及对照组相比较,对BMSC有明显的促增殖作用,其中RBX组总体强于CPC复合组;而FG复合组在试验期内对BMSC的增殖效应在第6-8天时高于RBX组和CPC复合组(p<0.05),第10天开始低于这两组。细胞的ALP酶活性测定结果显示,7天时, FG复合组ALP酶活性分别高于CPC复合组及RBX组,其与CPC复合组相比较,具有显著性差异(P<0.05)。但在14天时,FG复合组ALP酶活性显著低于CPC复合组、RBX组及对照组(P<0.05),且与7天时本组细胞ALP酶活性比较无显著性差异(P>0.05),而CPC复合组及RBX组ALP酶活性均显著高于7天时本组细胞的ALP酶活性(P<0.05)。14天时,各组细胞均检测到了I型胶原的表达,其中RBX组细胞的I型胶原表达水平要高于其他各组(P<0.05)。实验结果表明,三种复合材料中,具有良好生物降解性、多孔隙率的RBX不仅可明显促进BMSC成骨表型的表达,而且促进了细胞的增殖。FG复合组与CPC复合组相比较,FG自身由于降解过快,导致BMP流失过早,使得诱导BMSC数量有限。CPC尽管降解缓慢,却可达到持续诱导干细胞的作用,但其释放BMP的速度仍显缓慢,有待进一步改善。3、两种注射型生物材料复合BMP对兔前交叉韧带重建术后腱-骨间愈合影响的实验研究分别选取注射型纤维蛋白胶(FG)及注射型磷酸钙骨水泥(CPC)复合牛bBMP构建注射型生物材料,应用于兔前交叉韧带重建手术,在体观察它们对骨隧道内的骨生长及移植肌腱与骨隧道之间愈合的影响。结果表明,FG复合材料及CPC复合材料均可促进腱-骨间新生骨的生长。术后6周,两组标本腱-骨间骨矿化组织密度(BMD)均明显高于对照组,FG复合组BMD值高于CPC复合组,但二者无显著性差异;术后12周,CPC复合材料组腱骨间的BMD值最高,但两组材料组与对照组相比均无显著性差异。实验还发现,由于二者在体内生物降解率的不同,FG复合材料组腱-骨间新生骨的生成具有爆发效应,6周达到最高,12周趋于稳定,而CPC复合材料组腱-骨间新生骨的生成则呈现缓慢上升的趋势,至12周时,仍有新骨形成。但两组腱-骨间均未见形成类似于原ACL正常止点的直接连接,而都形成了以Sharpey样纤维胶原连接为主的间接连接。生物力学检测发现,由于CPC降解较慢,所以6周时它自身与骨隧道之间的把持力及新生骨的共同作用,使得其最大牵拉力明显高于FG复合组及对照组,但至12周时,最大牵拉力尽管仍大于FG复合组,但已无明显性差异。上述结果显示CPC的BMP释放效率有待改善。4、多孔性三维结构生物材料与注射型支架材料分别复合BMP对前交叉韧带重建术后腱-骨间愈合影响的比较研究本实验采用具有三维立体多孔隙结构、集骨诱导性及骨传导性为一体且在临床应用已取得良好效果的重组合异种骨(RBX)来促进腱-骨愈合。Micro-CT结果显示,术后6、12周RBX组腱-骨之间的骨矿化组织密度(BMD)数值均高于对照组,并具有显著性差异(p<0.05)。组织学结果显示,术后2周,RBX组腱-骨之间被大面积不规则分布的软骨样细胞填充;术后6周,RBX组的腱-骨之间已见大量成熟软骨细胞,并开始分泌基质,而对照组术后腱-骨间一直被纤维样结缔组织连接,至术后12周,RBX组部分标本出现类ACL正常肌腱止点。生物力学结果同样证实,RBX组的最大牵拉力均显著高于对照组。因此应用RBX可以显著提高ACL重建术后腱-骨间愈合。但仍不清楚不同特性三种载体材料复合BMP后是否对促进早期腱-骨间生物愈合具有不同影响。本实验在实验一、二及三的基础上,对三种复合生物材料促进腱-骨间愈合进行了对比研究。借助组织学观察、生物力学检测、Micro-CT等分析方法,发现具有三维立体结构多孔隙的固态支架载体RBX负载BMP后不仅可以为ACL重建提供初始的协同固定作用,而且对于BMP作用的放大及促进骨生长的作用均优于其他两种注射型支架材料。此研究为今后应用固态三维立体多孔性载体支架材料促进腱-骨界面的愈合提供了基础。