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研究目的1．筛选人源性抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)重组抗原结合片段(fragment for antigen binding，Fab)抗体；2．表达纯化抗EGFR Fab；3．对抗EGFR Fab功能进行鉴定；4．标记化疗药物紫杉醇于Fab，观察其体外抗肿瘤效果。研究方法1．通过固相筛选法或联合固相筛选法与基于细胞表面的差减筛选法从噬菌体抗体库进行抗体片段筛选，通过酶联免疫吸附反应进行阳性克隆的鉴定，并测定比较其可变区序列；2．于大肠杆菌Top 10F’中表达Fab，并通过固相金属鏊合亲和层析技术与离子交换技术进行两步法抗体纯化；3．应用酶联免疫吸附反应、免疫沉淀、荧光激动的细胞计数以及免疫荧光技术对纯化的抗体特异性进行鉴定；通过非竞争酶联免疫吸附技术计算亲和力；通过标记皂角素的抗人免疫球蛋白试剂盒观察该重组抗体与肿瘤细胞表面EGFR结合后的内化能力；4．将紫杉醇标记到Fab，通过MTT法观察不同浓度标记的紫杉醇对肿瘤细胞株A431以及正常细胞系NIH／3T3增殖的影响，比较相同浓度标记／非标记的紫杉醇对体外培养的肿瘤细胞株A431增殖的影响；通过TUNEL assay观察免疫标记药物对肿瘤细胞诱导凋亡的作用。研究结果1．基于CV-1／EGFR-1细胞株的筛选得到了两株亲和力较低的轻链为κ链的Fab，而联合运用固相筛选与基于NIH／3T3与A431细胞株的筛选得到了具有一定亲和力的λ链Fab；2．Fab在一定条件下可以经诱导于Top 10F’中表达，并经两步纯化法得到较高纯度的蛋白；3．功能鉴定证实抗EGFR Fab能够与肿瘤细胞以及肿瘤细胞表面具有天然构象的EGFR结合；结合解离常数约为30.9 nM；结合后能够内化；4．标记于Fab的紫杉醇作用强度提高4.5倍，在未标记紫杉醇无明显作用时即引起细胞凋亡，而对正常细胞系NIH／3T3的增殖则基本没有影响。结论通过噬菌体展示技术从抗体库中筛选出的具有内化功能的抗EGFR Fab可以通过与传统化疗药物紫杉醇的连接用于过度表达EGFR的实体瘤的靶向治疗。