论文部分内容阅读
目的:根管内钙化是临床上年轻恒牙牙髓再生治疗(regenerative endodontics treatment,RET))后常见的并发症,组织学上根管内新形成的硬组织是骨样或者牙骨质样的矿化组织,因此如何促进更多的牙本质形成成为临床关注的焦点。外泌体(Exosome)是干细胞旁分泌活动中的关键性调节因子,能够被受体细胞胞吞,改变受体细胞的生物学性能。本实验旨在探索根尖牙乳头干细胞(stem cells from apical papilla,SCAP)来源的外泌体(exosomes derived from stem cells from papilla,SCAP-Exo)对大鼠(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMMSCs)增殖及牙本质向分化的作用,为牙源性干细胞外泌体应用于再生性牙髓治疗促进牙本质再生奠定理论依据和实验基础。研究方法:分离提取SCAP及BMMSCs并鉴定。采用差速离心法提取SCAP-Exo,通过透射电镜对外泌体形态进行观察;Western blot检测外泌体特异性标记蛋白CD9、Alix的表达。免疫荧光染色及活细胞成像观察BMMSCs胞吞SCAP-Exo的过程。用含有不同浓度SCAP-Exo(0,5,20,80μg/mL)条件培养基处理BMMSCs,CCK-8实验检测SCAP-Exo对细胞增殖的影响;qRT-PCR及Western blot分别检测成骨相关分子ALP、Runx2及成牙本质相关分子DSPP基因和蛋白的表达水平;茜素红S染色检测矿化结节形成能力。实验结果采用SPSS18.0软件包进行统计学分析,组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:差速离心法能够成功从SCAP培养上清中提取SCAP-Exo,透射电镜下可见SCAP-Exo大小约30-150 nm、呈杯盘状的双层膜结构,Western blotting显示SCAP-Exo表达CD9、Alix。荧光显微镜下可见,PKH26标记的红染外泌体位于BMMSCs胞浆内;荧光共聚焦显微镜下可见绿色荧光染料PKH67标记的SCAP-Exo逐渐被BMMSCs胞吞的过程。CCK-8结果显示,SCAP-Exo对细胞的增殖无明显作用(P>0.05)。SCAP-Exo能够提高DSPP蛋白及基因的表达,然而对Runx2、ALP的表达无明显影响。同时,茜素红S染色显示SCAP-Exo能够促进BMMSCs矿化结节的形成,且随着外泌体浓度的升高,促进BMMSCs矿化的能力越强(P<0.05)。结论:SCAP-Exo能够被BMMSCs内吞,促进BMMSCs的成牙本质向分化。