目的 课题组曾证明丹参水溶性提取物能有效防治糖皮质激素引起的大鼠骨质疏松，对糖皮质激素诱导的体外骨髓基质干细胞(Marrowstromalcells，MSCs)的成脂分化有抑制作用，丹酚酸B是丹参水溶性成分的主要有效成分之一，本研究通过观察丹酚酸B对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞(osteoblast，OB)增殖、分化的影响，以探讨丹酚酸B对骨细胞的作用及作用机制；通过观察丹酚酸B对骨髓基质干细胞成骨分化和成脂分化的影响，以探讨丹酚酸B对干细胞分化方向的调节作用；通过观察丹酚酸B对骨髓基质干细胞成骨分化过程中一氧化氮(NO)的影响，进一步阐明丹酚酸B的抗骨质疏松作用机制。 方法 1丹酚酸B对体外培养成骨细胞的影响：采用酶序列消化分离培养法培养新生大鼠颅骨成骨细胞。应用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、碱性磷酸酶染色法、茜素红染色法、放射免疫测定法等方法鉴定成骨细胞和观察丹酚酸B对体外培养新生大鼠颅骨成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量、骨结节数目和面积的影响。 2丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞方向分化的影响：密度梯度离心法和传代贴壁筛选法相结合，分离纯化大鼠骨髓基质干细胞。基质细胞成骨分化时，通过检测碱性磷酸酶活性、骨钙素含量和骨保护蛋白及其配体mRNA表达，观察丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的影响；基质细胞成脂分化时，通过油红染色和检测脂质过氧化物体增殖物激活受体γ2mRNA表达，观察丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向脂肪细胞分化的影响。3丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化时NO途径的影响：选用传代的大鼠骨髓基质干细胞，把细胞分成9组：阴性对照组、成骨诱导对照组、N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)组、丹酚酸B组、丹参素组、雌二醇组、L-NAME+丹酚酸B组、L-NAME+丹参素组和L-NAME+雌二醇组。检测细胞上清NO含量、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量和骨保护蛋白及其配体mRNA表达，以评价丹酚酸B是否通过NO途径影响骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化。 结果： 1丹酚酸B对成骨细胞的影响：丹酚酸B对新生大鼠成骨细胞的增殖没促进作用，高浓度(10-5mol/L)时对成骨细胞的增殖有抑制作用。丹酚酸B可促进成骨细胞表达碱性磷酸酶，1×10-7mol/L浓度组作用7天时效果最明显。丹酚酸B可刺激成骨细胞分泌骨钙素，在药物作用第13天时骨钙素分泌量最大。丹酚酸B明显增加成骨细胞骨结节总面积，但对骨结节数量影响较少。 2丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞方向分化的影响：结合密度梯度离心法和传代贴壁筛选法，分离纯化得到较为均一的大鼠骨髓基质干细胞，经诱导后可向成骨细胞和脂肪细胞方向分化。在没加入成骨诱导剂的情况下，5×10-7mol/L浓度组的丹酚酸B可增加MSCs碱性磷酸酶活性，在加入成骨诱导剂后，丹酚酸B增加MSCs碱性磷酸酶活性的作用明显增加，其中5×10-8mol/L浓度组作用最为明显。传代培养的MSCs培养22天也可以表达低浓度的骨钙素。在没成骨诱导情况下，丹酚酸B也可以促进MSCs分泌骨钙素，药物最佳作用浓度是5×10-7mol/L，在添加成骨诱导剂的情况下，丹酚酸B促进MSCs分泌骨钙素的作用更明显。5×10-7mol/L和2.5×10-6mol/L浓度组的丹酚酸B可使成骨诱导后的MSCs的OPG表达增加，RANKL的表达减少，OPG和RANKL比值增大。5×10-7mol/L和2.5×10-6mol/L浓度组丹酚酸B对MSCs成脂诱导后PPARγ2的表达有抑制作用。 3丹酚酸B对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化时NO途径的影响：MSCs成骨诱导后，细胞上清NO含量、碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均增加，OPG和RANKL的mRNA比值增加，与成骨诱导对照组相比，L-NAME通过抑制一氧化氮合酶，抑制了MSCs的NO分泌，细胞上清NO含量明显减少，碱性磷酸酶活性和骨钙素含量均减少，OPG和RANKL的mRNA比值下降。丹酚酸B能增加骨髓基质干细胞上清NO含量，增加MSCs的碱性磷酸酶活性和骨钙素含量，使OPG和RANKL的mRNA比值升高。与L-NAME组相比，L-NANE+丹酚酸B组明显增加药物作用第7天MSCs的碱性磷酸酶活性和22天骨钙素含量，使OPG和RANKL的比值有所增加，说明丹酚酸B能逆转L-NAME对MSCs的成骨抑制作用。 结论 丹酚酸B可促进成骨细胞表达碱性磷酸酶，促进骨钙素分泌，促进矿化结节形成。丹酚酸B能促进骨髓基质干细胞向成骨细胞方向分化，表现为增加骨髓基质干细胞碱性磷酸酶活性和骨钙素含量，使OPG和RANKLmRNA比值增加。实验浓度的丹酚酸B对骨髓基质干细胞向脂肪细胞方向分化有影响，对PPARγ2mRNA的表达有所抑制。丹酚酸B可促进成骨诱导的MSCs的NO分泌，能逆转L-NAME对MSCs的成骨抑制作用，提示丹酚酸B可能通过NO途径来刺激骨髓基质干细胞的成骨分化和功能。