蛋白酶抑制剂是对蛋白酶有专一抑制作用的一类小分子化合物或多肽的总称，普遍存在于植物、动物和微生物中。蛋白酶抑制剂具有维持机体内环境稳定，抗HIV、抗虫和抗真菌以及抑制肿瘤细胞增殖等活性。荞麦胰蛋白酶抑制剂(BTI)来自荞麦种子，属于Potato I型蛋白酶抑制剂家族，由69个氨基酸组成，分子量为7.9 kDa。前期研究结果表明，重组荞麦胰蛋白酶抑制剂(rBTI)能抑制某些肿瘤细胞增殖，如EC9706、K562、Hep G2、Hela等，而对正常肝细胞HL7702没有影响。但rBTI抑制肿瘤细胞增殖的具体分子机制和靶点还不明确。本文以rBTI为材料，探究其对Hep G2细胞增殖抑制的可能分子机制。研究内容主要围绕三个方面开展：　　1.采用MTT法和流式细胞术分别检测了rBTI对Hep G2细胞增殖以及细胞周期的影响，免疫荧光及Western印迹法检测了PTEN和p-PTEN的亚细胞定位及蛋白表达的变化，采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及Western印迹法检测了周期相关蛋白的表达，旨在探究PTEN和p-PTEN在rBTI抑制Hep G2细胞增殖和周期阻滞中的作用。结果表明，rBTI能显著抑制Hep G2细胞增殖，将细胞周期阻滞在G0/G1期，并呈时间和剂量依赖性；rBTI作用于Hep G2细胞后，可显著上调PTEN和p-PTEN的表达，同时发现过表达的p-PTEN分布于细胞核中，能与核仁共定位；周期相关蛋白检测表明，细胞内p53、p21转录水平和蛋白水平均增加。由此说明，rBTI通过上调PTEN表达，使得细胞周期阻滞于G0/G1期，进而抑制Hep G2细胞增殖。　　2.采用qRT-PCR法检测rBTI对PTEN基因表达的影响，采用流式细胞术和荧光显微镜观察细胞内ROS的变化情况，通过Western blot法检测rBTI和rBTI联合ROS清除剂NAC作用于Hep G2细胞后，细胞中PTEN、p-PTEN的变化情况，旨在探究PTEN变化情况与细胞内ROS之间的关系。结果表明，rBTI作用于细胞后，PTEN基因表达和ROS生成增加；Western blot结果表明，rBTI使细胞中PTEN和p-PTEN表达上调；而当用NAC作用Hep G2细胞后，细胞内ROS水平有所下调，同时细胞内PTEN和p-PTEN的表达也随之下调。因此，我们得出结论，细胞内PTEN表达升高由rBTI诱导的ROS所介导。　　3.采用MTT法检测rBTI和自噬抑制剂3-MA对Hep G2细胞增殖的影响，通过质粒转染和Western blot检测rBTI以及rBTI联合磷酸酶抑制剂phen对EGFP-LC3分布以及自噬相关蛋白LC3和p62表达的影响，通过Western blot检测rBTI以及rBTI　　联合phen对PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白表达的影响。结果表明，rBTI抑制Hep G2细胞增殖是通过自噬诱发的；当rBTI作用于已转染pEGFP-LC3质粒的Hep G2细胞后，细胞中EGFP-LC3蛋白表达上调，并且LC3的聚集状态发生明显变化，胞质中的LC3以点状形式存在；Western blot结果表明，rBTI作用于Hep G2细胞后，细胞内LC3 II/I比值升高、自噬底物p62表达降低，同时发现PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-AKT和p-mTOR表达降低；与rBTI单独处理组相比，rBTI和phen联合作用于细胞后，细胞中EGFP-LC3蛋白表达有所下调，Western blot结果中LC3 II/I比值下调、自噬底物p62表达有所升高，并且发现PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白p-AKT、p-mTOR表达有所恢复。因此，推测rBTI通过上调PTEN的表达，抑制PI3K/AKT通路，从而诱导Hep G2细胞发生自噬。　　综上所述，rBTI作用于Hep G2细胞后，使细胞周期阻滞于G0/G1期，进而抑制Hep G2细胞的增殖；rBTI刺激细胞内ROS产生；升高的ROS上调抑癌蛋白PTEN表达，进而影响PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导细胞发生自噬。这些研究内容为从分子水平上了解该类蛋白质抑制肿瘤细胞增殖及促进细胞自噬的分子机制、揭示分子间相互作用的可能模式等内容提供了理论依据。