邻苯二甲酸酯（phthalate acid esters，PAEs）是一类结构相似的化学物质，广泛应用于工农业生产中，环境污染非常普遍。邻苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate，DBP）是使用量最大、污染最为严重的PAEs之一。尿液PAEs代谢产物检测显示，DBP代谢产物邻苯二甲酸单丁酯（mono-butyl phthalate，MBP）含量最高，说明DBP的人体内暴露水平最高。研究表明DBP和MBP对雄激素与其受体结合无干扰作用，但是动物实验却显示出明显的抗雄激素效应，此效应主要由MBP引起，可能与影响雄激素的生物合成有关。DBP和MBP影响雄激素合成的具体机制目前尚不清楚。本研究以小鼠间质细胞瘤细胞（mouse Leydig tumor cells，MLTC-1）为模型探讨MBP影响类固醇激素合成的机制。第一部分MBP对MLTC-1细胞类固醇激素合成的影响目的：探讨MLTC-1细胞对hCG等刺激剂的反应性以及MBP对MLTC-1细胞类固醇激素合成的影响。方法：细胞预培养24h贴壁后改为无血清培养液并用hCG、CT或forskolin刺激，刺激结束后收集培养液待测孕酮。在另一实验中，预培养24h后用MBP染毒24、48、72h，染毒结束后再用hCG刺激4h，收集培养液待测孕酮。孕酮测定用放射免疫法。细胞活性试验使用MTT法和³H-TDR法。结果：hCG、CT或forskolin刺激MLTC-1细胞孕酮合成表现为剂量-关系性上升。MBP浓度在低于10^-3mol／L时对细胞活性未产生显著性影响。此外，MBP对孕酮合成的作用表现为双向调节趋势，低剂量(10^-7-10^-6mol／L)时表现为兴奋效应、高剂量时表现为抑制效应。结论：MLTC-1细胞对hCG、CT或forskolin等具有良好的刺激反应性。低剂量MBP对类固醇激素合成的影响具有“低剂量兴奋效应”。下列剂量可以用于研究MBP生殖内分泌干扰作用，即：10^-9，10^-8，10^-7,10^-6，10^-5，mol／L和50，100，200，400 and 800μmol／L。第二部分hCG-cAMP-PKA通路在MBP影响MLTC-1细胞类固醇激素合成中的作用目的：探讨hCG-cAMP-PKA通路及胆固醇转运在MBP影响类固醇激素合成中的作用。方法：细胞预培养24h贴壁，用MBP处理细胞24h。处理结束后分别用hCG、CT、8-Br-cAMP、22R-HC或孕烯醇酮刺激4h。处理结束后，收集上清测定孕酮或者收集细胞提取蛋白和mRNA。放射免疫法测定孕酮和细胞内cAMP水平、western blot测定蛋白表达、实时定量PCR分析mRNA表达水平。结果：MBP在10^-7和10^-6mol／L时对hCG、CT和8-Br-cAMP刺激的孕酮合成具有明显的刺激作用。相反，MBP在大于或等于200μmol／L则具有抑制效应。此外，MBP对hCG、CT和forskolin刺激的细胞内cAMP水平未见有明显的影响。当培养液中有22R-HC或孕烯醇酮存在时，MBP对孕酮合成的影响被抵消，说明MBP对P450scc和3β-HSD的活性未产生明显的作用，可能作用位点是胆固醇转运过程。StARmRNA、StAR蛋白及PBR mRNA测定的结果证明了这一假设，因为StAR和PBR是调节胆固醇转运的关键蛋白。结论：MBP对类固醇激素合成的影响表现为双向调节效应，主要通过调节胆固醇转运影响类固醇激素合成。胆固醇转运既是高剂量MBP抑制效应的作用位点，也是低剂量刺激效应的作用位点。第三部分PKC信号通路及钙离子在MBP影响MLTC-1细胞类固醇激素合成中的作用目的：探讨蛋白激酶C（PKC）和钙信号系统在MBP影响类固醇激素合成中的作用。方法：细胞预培养24h贴壁，用MBP处理细胞24h。处理结束后分别用hCG和佛波酯（PMA）、蛋白激酶A抑制剂（PKI）、花生四烯酸（AA）、钙离子螯合剂（EGTA）、钙通道阻滞剂（VER）、钙离子载体（A23187）和Ca²⁺-ATP抑制剂（TG）处理4h。收集上清放射免疫法测定孕酮。细胞内钙离子浓度([Ca²⁺]i)以fluo3／AM为探针用激光共聚焦系统测定。结果：PMA和PKI能显著抑制hCG诱导的孕酮合成。MBP在10^-5和10^-6mol／L以下剂量对孕酮合成的刺激作用分别被PMA和PKI完全抵消。用AA与hCG联合刺激后，MBP≤10^-4mol／L时的刺激效应消失，染毒组的孕酮合成水平与对照组相比无显著性差异。当培养液中无Ca²⁺或Ca²⁺被EGTA螯合后，MBP对孕酮合成的影响完全消失。虽然Ca²⁺载体A23187可显著增加hCG刺激的孕酮合成，但是对MBP诱导的孕酮合成变化趋势没有改变。同样地，钙通道阻滞剂VER虽然可显著降低hCG刺激的孕酮合成，但是影响MBP诱导的孕酮合成变化趋势也没有改变。当培养中同时存在hCG和Ca²⁺-ATPase抑制剂TG时，MBP对孕酮合成的影响在200μmol／L以下剂量时消失。[Ca²⁺]i检测结果显示，胞外无Ca²⁺时10^-6mol／L MBP可使[Ca²⁺]i快速上升，而10^-3mol／L MBP则对[Ca²⁺]i产生抑制效应。结论：MBP在较低剂量影响类固醇激素合成的机制可能与PKC、AA及钙信号系统有关，钙信号系统可能主要参与较高剂量MBP的作用。