论文部分内容阅读
附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品,是温里药中常用药物之一,首载于《神农本草经》,被称为“百药之长”,又誉为“回阳救逆第一要药”。为了进一步研究附子强心的分子作用机制,本研究通过盐酸普罗帕酮制作急性心力衰竭大鼠模型,采用高通量转录组测序分析技术,对心力衰竭大鼠的心肌组织进行转录组测序,检测所有基因的表达情况,通过功能注释、富集分析与差异表达基因筛选,定位附子治疗急性心力衰竭相关的关键基因和信号通路,以期在转录组水平上阐释附子治疗急性心力衰竭的分子机制。方法:1.通过左心室插管的方法来监控健康成年大鼠的心率与心室内压,股静脉注射盐酸普罗帕酮制作急性心力衰竭模型,造模成功后,分别对各组大鼠进行给药:阳性给药组给予参附注射液(3.3 mL·kg-1),模型组给予蒸馏水0.1 mL·kg-1,给药组给予附子水煎液(1.25 g·kg-1,2.50 g·kg-1,5.00 g·kg-1)。记录其造模前后与给药后5、10、20、30、60 min的HR、+LV dp·dtmax-1及-LV dp·dtmax-1的变化。另取一批大鼠,以同样的方式进行急性心力衰竭造模给药,给药二十分钟后对各组大鼠进行腹主动脉采血,采用酶联免疫吸附法(Elisa)测定其血清中各细胞因子(Ang-II、TNF-α、BNP、ANP、ALD)的含量水平及其活性变化。2.以空白组、模型组及附子水煎液给药组大鼠的心肌组织为实验材料,分别进行总RNA提取一逆转录一cDNA文本数据库构建,通过HiSeq X-ten平台进行高通量测序,构建大鼠心肌组织的转录组样本数据库。通过GO功能注释、DEG分析、KEGG富集分析以及表达量差异分析过程,筛选出附子对心力衰竭挥治疗作用的候选关键基因与信号通路。3.采用荧光定量PCR(QRT-PCR)技术对上一步骤筛选出的部分候选基因的mRNA表达水平进行转录活性验证。结果:1.用普罗帕酮造模之后的大鼠,HR与+LVdp·dtmax-1、-LVdp·dtmax-1值均出现下降,附子水煎液1.25 g·kg-1、2.50 g·kg-1、5.00 g·kg-1十二指肠给药后,可有效升高模型大鼠的HR、+LVdp·dtmax-1和-LVdp·dtmax-1,而血清中Ang-II、ANP、BNP、ALD、TNF-α等指标均有所降低。2.高通量RNA-seq测序共获得227,662,430个高质量碱基序列,碱基数67,974,816,306 bp,Q30在90.32%及以上,各样品的Reads与参考基因组的比对效率在93.02%一93.47%不等,有较高的比对。3.在FDR