论文部分内容阅读
目的：扩增含有能特异性阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路的小干扰RNA(smallinterferning RNA，siRNA)重组质粒的重组腺病毒PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD，利用PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD特异性地阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路后，观察其对人胃癌SGC7901细胞增殖、凋亡和自噬的影响。
方法：①利用293T细胞扩增重组腺病毒PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD及对照腺病毒NC-RNAi-GFP-AD并测定其滴度，同时测定PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD对人胃癌SGC7901细胞的最佳感染复数；②重组腺病毒PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD转染人胃癌SGC7901细胞24h、48h、72h作为实验组，对照腺病毒NC-RNAi-GFP-AD转染人胃癌SGC7901细胞72h作为对照组(MTT中对照组为NC-RNAi-GFP-AD转染细胞24h、48h和72h)。③利用PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD转染人胃癌SGC7901细胞，siRNA阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路后，采用MTT法测定其对SGC7901细胞增殖的抑制作用，应用流式细胞技术JC-1法检测其对SGC7901细胞线粒体膜电位的影响，应用MDC荧光染色法及透射电镜观察自噬的发生，Western blot测定自噬特异性蛋白微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 light chain3，LC3)表达，计算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值反映细胞自噬水平。
结果：①大量扩增得重组腺病毒PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD及对照腺病毒NC-RNAi-GFP-AD，并测得两者的滴度分别为1.0×1011pfu/L和0.9×1011pfu/L，腺病毒对胃癌SGC7901细胞感染复数(multiple of infection，MOI)为50时转染效果最好。②PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD转染胃癌SGC7901细胞后胃癌SGC7901细胞的增殖明显受到抑制，24h、48h、72h抑制率分别为27.48％±2.7％、41.92％±2.02％、50.85％±0.92％；流式细胞术检测结果显示实验组绿色荧光的细胞占总细胞的比值24h、48h、72h分别为18.5%±1.64％、39.5％±1.70％、55.8％±1.86％，对照组为12.6％±1.11％(P<0.05)，绿色荧光的细胞数量占总细胞数的比值越大，线粒体膜电位就越低；MDC荧光染色及透射电镜观察结果显示：实验组随着时间延长(24h、48h、72h)自噬囊泡逐渐增多，对照组自噬囊泡比实验组各组都少；LC3的表达实验组24h、48h、72h LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值分别为0.293±1.481％、0.488±1.199％、0.889±1.190％，而对照组比值为0.123±1.225％(P<0.05)。
结论：①成功扩增的重组腺病毒PI3K(Ⅰ)-RNAi-AD滴度达1.0×1011pfu/L；腺病毒对人胃癌SGC7901细胞的最佳感染复数为50。②siRNA阻断Ⅰ型PI3K信号传导通路后胃癌SGC7901细胞的增殖明显受抑制，细胞凋亡明显增强，自噬水平明显上调。