论文部分内容阅读
顺式环氧琥珀酸水解酶(CESH)可以催化顺式环氧琥珀酸生成L(+)-酒石酸,但是该酶稳定性差,目前还只能采用整菌催化方式生产L(+)-酒石酸。固定化酶在提高酶的稳定性方面有其独特的优势,能避免生产周期长、生成的副产物影响目的产物分离纯化等缺点,因此可以对CESH进行固定化以提高其稳定性。
纤维素价格低廉,性质稳定,生物相容性好,能作为酶固定化的良好载体。碳水化合物结合模块(CBM)是存在于多种降解木质纤维素酶中的非催化模块,它能特异识别纤维素底物,可用于介导酶在纤维素基载体上的固定化。本研究选择来源不同的五个CBM分别融合在CESH的N端进行表达,采用微晶纤维素作为载体制备固定化酶。研究了原酶、游离融合酶和固定化融合酶的基本酶学性质,并验证了融合CBM及通过CBM固定化到纤维素后对酶的稳定性提升的效果。
通过酶活力测定表明,游离的和固定化的融合酶比原酶有更宽的适宜pH、适宜温度范围。游离形式、固定化形式的融合酶与原酶的动力学参数显著不同,其中经固定化的CBM30-CESH的催化效率kcat/km为236.47mM-1·min-1,是原酶(97.81mM-1·min-1)的2.3倍。融合CBM后的游离酶稳定性稍有提高,但经纤维素固定化后酶的稳定性有不同程度的提高。其中固定化的CBM30-CESH的稳定性显著提高,在30℃下半衰期达210min,是原酶半衰期(46.2min)的4.5倍。其它固定化融合酶在30℃条件下的半衰期也延长到原酶的3-4倍。当温度升高至55℃时,固定化对酶稳定性的提高作用明显下降。
融合CBM拓宽了CESH的最适pH和最适温度范围,通过亲和固定化提高了酶的稳定性。而且不同来源的CBM对酶稳定性提高的程度不同,这与CBM本身性质有关,而与来源菌株的嗜热性质无关。融合CBM30的固定化酶表现出最高的催化效率和最长的半衰期,因此CBM30可以作为良好的融合标签对CESH进行融合表达和一步纯化固定制备固定化酶,提高酶的稳定性。