用叶圆盘法建立盐芥的遗传转化体系

来源 :山东师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dashanLau
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盐芥与拟南芥近缘,具有拟南芥很多同样的优点以作为实验系统:如类似的形态、小的基因组、短的生活史、丰富的种子和易于被转化等。但是,盐芥是真盐生植物,短时间内能耐受高达500mMNaCl的冲击,在盐适应前后既不产生盐腺也没有复杂的形态上的变化,表明其耐盐性很大程度上源于基本的生理和生化机制。此外,盐芥和拟南芥在cDNA和氨基酸水平上分别有90%和95%的同源性,可以方便的将拟南芥的很多信息(基因、蛋白质数据库以及突变体系等)移至盐芥耐盐性的分子生物学研究。目前,对盐芥生理生化的研究、基因表达的研究,以及各种cDNA文库、突变体库的建立,已经使盐芥成为一种非常有价值的耐盐模式系统。 盐芥也具有拟南芥不具有的优点如耐逆性强等。但盐芥的研究刚起步,利用其作为模式植物还存在困难:只存在EST数据库;虽可用方便地使用Floral Dip法进行转化,但较好的转化效率也仅为0.1%,盐芥有成为盐生模式系统的先天优越条件,但目前尚未建立起一套完整的栽培技术和转化体系,因此还未能为分子生物学家所用。随着耐盐基因工程新策略的不断发展和盐芥转化体系的逐步完善,植物耐盐基因工程会有很广阔的前景。因而探索效率高的筛选方法将是建立盐芥转化体系至为关键的问题,本项研究以Bar基因作为筛选标记的有效载体为筛选提供了极大的方便。 目前已经有农杆菌花浸染法转化盐芥成功的报道,但转化效率均较低,因而很难说已经建立起了有效的农杆菌介导盐芥遗传转化体系。鉴于农杆菌介导法的诸多优点,对于基因组相对复杂的盐芥而言,进一步加强对其转化系统的研究具有重要意义。 本研究的目的在于探索影响农杆菌介导转化盐芥的重要因素,研究不同的生长调节物质对愈伤组织诱导、芽的分化和根诱导的影响,完善组培技术,建立高效的植株再生体系,优化农杆菌转化盐芥的各参数及条件,为建立高效率的农杆菌介导的盐芥遗传转化体系奠定基础,同时利用研究bar基因的转化来探讨建立盐芥的遗传转化体系,利用建立的转化体系进行盐芥遗传转化研究。 本实验主要利用盐芥的叶片作为材料,建立了盐芥的再生体系,并在此基础上进行了农杆菌介导的bar基因的转化,分析探讨了影响转化效率的各种因素,初步优化遗传转化体系。主要结果如下: 1 建立了盐芥的再生体系。本实验得出愈伤组织的诱导是以MS为基本培养基,附加1mg/L BA+0.5mg/LNAA的效果为最佳,然后及时转接到MS十1mg/LBA+0.5mg/INAA的培养基上诱导芽的分化。生根培养是以1/2MS的培养基为最佳。 2 初步建立盐芥遗传转化体系。以bar基因作筛选标记初步建立了转化体系:用盐芥的叶片作侵染材料,预培养2d,在OD值为0.4-0.5的农杆菌液中侵染6-8min,共培养24-36h,然后叶片转接到含MS+1mg/LBA+0.5mg/LNA A+500mg/L Cef+50ppm basra(pH5.8)培养基上进行筛选培养。PCR检测初步表明外源基因已经整合到植物基因组中。
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