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稻米是人类最重要的粮食之一,它来自于水稻种子中的胚乳。水稻胚乳的发育主要包括细胞分裂与分化、多种储藏物质的合成与积累以及淀粉胚乳细胞的PCD等过程。迄今已研究报道了一些水稻胚乳发育相关的基因,但水稻胚乳发育的分子调控机理以及储藏蛋白积累的相关知识尚有限。本研究选取9个在水稻种子(胚乳)中高表达的基因,借助于RNAi、CRISPR以及超表达等技术获得目标基因的转基因材料,重点研究种子过敏原蛋白RAG2和AUX/IAA蛋白OsEn97在胚乳发育过程中的功能。本文还对水稻胚乳发育相关基因进行了差异表达分析,通过与其它植物胚乳表达基因的比较,以研究水稻胚乳差异表达基因的进化起源和功能变化。获得如下主要结果:1.转基因材料的创建。通过农杆菌介导的水稻愈伤遗传转化,我们获得了 9个水稻胚乳特异表达基因的RNAi转基因材料,3个基因的CRISPR转基因材料,3个基因的超表达转基因材料,以及2个基因的启动子连GFP报告基因的转基因材料。2.水稻种子过敏原基因RAG2的功能研究。RAG2蛋白包含10个半胱氨酸残基,以及19个与脂质转运蛋白同源的氨基酸残基。我们在水稻种子过敏原基因RAG2的功能研究中发现,RAG2在发育的种子中特异表达,在开花后14天的种子中表达量最高。RAG2超表达转基因T2代种子的粒长、粒宽、粒厚和千粒重较野生型显著增加;RAG2-RNAi转基因T2-5代的种子大小、结实率和千粒重较野生型显著降低,成熟种子中存在较严重的垩白现象,扫描电镜观察显示RNAi家系胚乳的淀粉颗粒形态异常、排列疏松。RAG2超表达家系的种子中蛋白质和脂质的含量显著高于野生型,而RAG2-RNAi家系的种子中蛋白质和脂质的含量都明显低于野生型。qRT-PCR检测显示,储藏蛋白相关基因(GluA、GluB、GluD和RM1)在RAG2超表达家系中普遍上调表达,而在RAG2-RNAi家系中表达降低,脂质合成相关基因(Os08g0510400和Os09g0505300)在RAG2超表达和RAG2-RNAi家系中分别上调和下调表达。以上结果表明,RAG2在水稻种子的蛋白质和脂肪的积累中具有重要功能,同时也影响胚乳淀粉颗粒的形态建成。3.水稻胚乳特异表达基因OsEn97的功能研究。OsEn97在种子中特异表达,在开花后7天的种子中表达量最高,它编码一个AUX/IAA类蛋白。OsEn97-RNAi转基因T2代家系的种子大小、结实率和千粒重都显著低于野生型,并产生一定比例的皱缩种子。细胞学观察结果表明,开花后3～7天的胚乳细胞数量较野生型显著减少,并出现一定比例的畸形胚或巨大胚。流式细胞仪检测显示,在7DAP的胚乳细胞数目减少。伊文斯蓝检测显示胚乳细胞的PCD(Programed Cell Death)过程较野生型提前发生。OsEn97表达下调导致细胞周期(E2F类)和储藏物质相关基因(GluA、GluB和GluD)的表达显著下降,而PCD相关基因的表达增加。通过酵母双杂筛库得到了六个与该蛋白互作的候选蛋白。这些结果表明,OsEn97可能参与水稻种子的发育和胚乳储藏物质积累的调控。4.水稻胚乳差异表达基因的分析。我们利用水稻芯片数据库CREP,筛选到水稻胚乳差异表达基因439个,包含胚乳特异高表达基因213个和特异低表达的基因226个。从MSU、KOME及Pfam等数据库中分别获得这些基因的基本生物学信息,包括KOME号、保守结构域、TIGR号、ORF长度、基因位置等信息。这439个水稻胚乳差异表达基因在染色体上的分布呈现无序性。将水稻胚乳差异表达基因在在拟南芥、杨树、玉米、高粱和小麦中进行同源基因的Blast,结果显示,在单子叶植物玉米(319个同源基因)、高粱(339同源基因)和小麦(304个同源基因)中得到的同源基因数量显著高于在双子叶植物拟南芥(同源基因175个)和杨树(195个)中的。根据同源基因的分布将439个水稻胚乳差异表达基因分为胚乳发育保守基因、单子叶植物胚乳发育特有基因和水稻胚乳发育特有基因三类。对拟南芥和玉米中的同源基因的表达谱分析发现,胚乳发育相关基因在单子叶植物和双子叶植物的进化过程中发生了变化,一部分基因功能保守地在单、双子叶植物中调控胚乳发育,另一部分基因则产生了新的功能,而水稻在进化过程中可能产生了一些新的基因参与胚乳发育的调控。